拟南芥RNA结合蛋白AtRGGA通过mRNA降解途径调控蔗糖代谢的机制研究

摘要

蔗糖作为植物的能量载体，经光合作用合成后，从源器官向库器官运输，是植物糖类运转的主要形式。蔗糖在植物体内被降解成己糖或己糖的衍生物参与代谢和生物合成，蔗糖及其代谢产物还可作为信号分子调控基因表达和植物生长发育，如：种子萌发、营养生长、生殖生长、植物衰老和胁迫应答等。研究蔗糖吸收利用及代谢的调控机制，将为培育高产作物新品种提供重要的理论依据。 拟南芥RNA结合蛋白AtRGGA突变后，表现出受蔗糖诱导的优势表型如莲座叶变大、果荚数增多、种子产量增加等。转录组测序分析发现，蔗糖添加培养条件下，rgga植株中蔗糖转运及代谢、叶绿素合成、根发育相关基因的表达水平明显高于野生型拟南芥。蛋白互作分析发现，AtRGGA与拟南芥5'-3'核酸外切酶AtXRN4互作，二者共同参与优势表型相关基因mRNA的降解。AtRGGA突变后，上述基因mRNA降解受阻，积累水平提高，增加了蔗糖的吸收利用，从而促进拟南芥生长。主要结果和结论如下： （1）蔗糖诱导拟南芥突变体rgga的优势表型。观察发现，2%蔗糖MS培养基上生长14d时，拟南芥突变体rgga长势明显优于野生型Col-0，而在无蔗糖MS培养基上二者生长表型无明显差异。Col-0和rgga植株在2%蔗糖MS培养基上生长14d后，移栽到基质中继续培养，对生长的相关指标莲座叶干鲜重、根的干鲜重、种子产量等进行了检测，结果显示，rgga的所有测定指标均明显优于Col-0。2%蔗糖MS培养基上生长5d移栽的30d苗龄植株蔗糖代谢关键酶的活力和叶绿素含量检测表明，rgga的上述指标都明显高于Col-0，这表明蔗糖早期添加培养可诱导rgga的后期生长优势表型。 （2）拟南芥突变体rgga与Col-0差异表达基因分析。2%蔗糖MS培养基上生长14d的拟南芥转录组测序分析显示，rgga突变体中，根分生区生长、泛素连接酶活性调控、蔗糖转运等基因的表达水平明显高于野生型。qRT-PCR检测表明，rgga的蔗糖代谢相关基因INVC、INVD、CWIN2、CWIN4、CWIN5、HXK3、FLN2、HKL1，蔗糖转运相关基因SUC3、SUC4、SUC7、SGB1，根发育相关基因PLT1、PLT2，以及叶绿素合成相关基因PORB、PORC、CAO表达量显著高于Col-0；且上述基因均受蔗糖诱导表达。以上结果表明，AtRGGA通过调控基因水平参与蔗糖转运及代谢、根的发育和叶绿素合成。 （3）AtRGGA影响优势表型相关基因mRNA的稳定性。为了进一步分析AtRGGA调控基因表达的分子机制，利用放线菌素D处理2%蔗糖MS培养14d的Col-0和rgga幼苗，通过qRT-PCR检测优势表型相关基因mRNA的半衰期。结果显示，AtRGGA突变增加了相关基因mRNA的稳定性。AtRGGA是一种RNA结合蛋白，因此推测，AtRGGA可能参与靶标mRNA的识别与结合。利用浸花法获得35S::GFP和35S::AtRGGA-GFP转基因拟南芥，筛选得到的纯合植株在2%蔗糖MS培养14d后整株取材，利用RNA结合蛋白免疫共沉淀技术（RIP）检测发现，AtRGGA与靶标mRNA的5'端特异性结合。 （4）AtRGGA与5'-3'核酸外切酶AtXRN4互作。为了进一步分析AtRGGA参与mRNA稳定性调控的分子机制，通过酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库，得到7个可能与AtRGGA互作的蛋白。通过免疫共沉淀和双分子荧光互补实验进一步证实AtRGGA与5'-3'核酸外切酶AtXRN4互作，且二者互作不受蔗糖有无的影响。对AtRGGA的RNA结合基序RGG box、HABP4-PAI-RBP1及核定位基序NLS突变分析发现，NLS1是AtRGGA与AtXRN4互作的关键结构域，且NLS1缺失突变体无法回补rgga的表型。这表明AtRGGA与AtXRN4的互作与rgga生长优势表型直接相关。 （5）xrn4-5呈现与rgga相似的表型。为了深入分析AtRGGA与AtXRN4之间的调控关系，通过常规杂交获得了rgga/xrn4双突植株（r/x），在蔗糖添加培养条件下，也呈现出生长优势表型。通过浸花法获得超表达AtXRN4的rgga（X/r）和超表达AtRGGA的xrn4-5(R/x)植株，二者均呈现与rgga类似的优势生长表型。检测发现，X/r、R/x、r/x、xrn4-5、rgga的NI、AI、HK酶活力及蔗糖诱导基因的表达水平均显著高于Col-0。上述结果表明，AtRGGA与AtXRN4在蔗糖诱导基因表达调控中共同发挥作用。RIP分析发现，AtRGGA存在时AtXRN4才能识别靶标mRNA，而AtXRN4的有无不影响AtRGGA对靶标mRNA的结合。这表明，AtRGGA可能通过引导AtXRN4识别靶标mRNA参与mRNA稳定性的调控。 （6）蔗糖诱导水稻OsRGGA RNAi株系的生长优势表型。RGGA广泛存在于植物中，OsRGGA与AtRGGA同源性约为48%，且NLS1基序保守。通过遗传转化获得OsRGGA RNAi转基因水稻（OsRGGAi）。在2%蔗糖MS培养基上，OsRGGAi水稻长势明显优于野生型，且NI、AI的活力和叶绿素含量都明显高于野生型；而用无蔗糖MS培养时，OsRGGAi与野生型水稻的生长无明显差异。上述结果表明，OsRGGA可能通过与AtRGGA相似的机制参与水稻蔗糖代谢及生长相关基因的调控，而其作用机制还有待进一步试验验证。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1植物蔗糖代谢

1.1.1植物蔗糖代谢的生物学意义

1.1.2植物蔗糖代谢途径

1.1.3植物蔗糖代谢的调控

1.2植物mRNA降解

1.2.1植物mRNA降解的生物学意义

1.2.2植物mRNA降解途径

1.2.3植物mRNA降解的调控

1.3本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶与各种生化试剂

2.1.4引物

2.2实验方法

2.2.1 CTAB法提取植物基因组DNA

2.2.2 T-DNA插入突变体的鉴定

2.2.3 TRIzol法提取拟南芥总RNA

2.2.4 cDNA的合成

2.2.5载体构建

2.2.7农杆菌介导的拟南芥浸花法转化

2.2.8转基因植株鉴定

2.2.9转录水平检测

2.2.10本生烟瞬时侵染

2.2.11干鲜重测定

2.2.12叶绿素含量测定

2.2.13蔗糖代谢关键酶活性测定

2.2.14根尖结构观察

2.2.15酵母双杂交

2.2.16免疫共沉淀

2.2.17双分子荧光互补实验

2.2.18 mRNA稳定性检测

2.2.19 RNA结合蛋白免疫共沉淀

2.2.20转基因水稻的获得

3 结果与分析

3.1 AtRGGA基因结构及表达模式分析

3.2蔗糖对拟南芥突变体rgga生长表型的影响

3.2.1拟南芥突变体rgga的鉴定

3.2.2蔗糖促进拟南芥rgga生长

3.2.3 AtRGGA突变促进蔗糖代谢

3.2.4 AtRGGA突变促进根发育

3.2.5 AtRGGA突变促进叶绿素合成

3.3野生型拟南芥和rgga基因表达差异分析

3.3.1转录组测序分析

3.3.2拟南芥生长相关基因表达水平检测

3.4 AtRGGA突变增加生长相关基因mRNA的稳定性

3.5 AtRGGA互作蛋白AtXRN4的鉴定及功能分析

3.5.1 AtRGGA与AtXRN4互作验证

3.5.2 AtRGGA与AtXRN4互作的关键结构域分析

3.5.3拟南芥突变体xrn4-5生长表型分析

3.6 AtRGGA与AtXRN4共同参与特定mRNA的5'-3' 降解

3.7水稻OsRGGA的功能分析

3.7.1 OsRGGA RNAi株系的获得

3.7.2 OsRGGA对水稻生长影响的分析

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况