RNA结合蛋白GPKOW在人前体mRNA剪接中的作用及机制研究

摘要

目的：RNA依赖的ATP水解酶DHX16属于DEXD/H-box解旋酶家族，在人前体mRNA（pre-mRNA）剪接过程中，催化ATP，促进剪接体复合物B向复合物C转化，为人pre-mRNA剪接过程所必需。研究发现，DEXD/H-box解旋酶水解ATP的功能常依赖相互作用蛋白的刺激与调控。在人类细胞中，是否也存在DHX16的作用蛋白，能够调控DHX16蛋白的ATP水解功能，至今尚不清楚。课题组前期以剪接因子DHX16为诱饵蛋白，应用酵母双杂交技术，成功捕获了GPKOW蛋白。在前期的研究基础上，本研究旨在检测GPKOW与RNA结合及与DHX16蛋白相互作用的特点，鉴定GPKOW蛋白是否为人类剪接体新成员，为人pre-mRNA剪接过程所必需，并在实验结果上，探讨GPKOW与DHX16蛋白相互作用在人pre-mRNA剪接过程中可能的作用机制。
　　方法：利用基因工程技术克隆GPKOW基因，并构建GPKOW的截断突变体和点突变体；在大肠杆菌DE3 pLysS系统以IPTG诱导表达His6-GPKOW融合蛋白，结合钴亲和树脂和poly（U）琼脂糖珠亲和层析法纯化His6-GPKOW融合蛋白；应用Northwestern和EMSA检测GPKOW蛋白与RNA结合；通过pull down和免疫共沉淀方法检测GPKOW与DHX16体外相互结合，并以体内剪接分析方法检测GPKOW在剪接过程中调控DHX16功能；提取HeLaS3细胞核，通过体外剪接分析方法鉴定GPKOW蛋白为人剪接体新成员，以及体外剪接体复合物分析方法确定GPKOW蛋白在剪接过程发挥作用的关键阶段。
　　结果：
　　1.人GPKOW蛋白与不同物种包括牛蛙(Q6NU07)、斑马鱼（Q90X38）及小鼠(Q56A08)的GPKOW同系物进行比对发现，GPKOW蛋白在G-patch、KOW1及KOW2结构域上有高度的保守性；
　　2.经酶切分析和测序结果显示，成功构建重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW和pEGFP-C1-GPKOW；重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW-△N，-△C，-△M及-△NC截断突变体；pET28a(+)/His6-GW和-GK点突变体及pEGFP-C1-GW和-GK点突变体；
　　3.结合钴柱和poly（U）琼脂糖珠亲和层析法纯化His6-GPKOW融合蛋白，经15％SDS-PAGE凝胶分离，考马斯亮蓝染色，结果可见蛋白纯度高，未见明显背景蛋白；
　　4.分离HeLa细胞核及细胞质蛋白成分，通过Western blotting鉴定GPKOW属于细胞核成分；荧光显微镜观察GFP-GPKOW定位于细胞核，呈弥漫分布；
　　5.Northwestern和EMSA方法确定GPKOW与体外转录合成的U2，U4，U5，U6 snRNA及pre-mRNA pRG1结合，KOW1结构域突变影响GPKOW-RNA结合；6.Pull down和免疫共沉淀结果显示GPKOW与DHX16蛋白体外相互结合， G-patch结构域突变导致GPKOW丧失与DHX16结合的能力，且RNA酶A消化细胞提取物的RNA后不影响GPKOW与DHX16体外相互结合，GPKOW与DHX16蛋白在正常生理盐浓度下相互结合，但NaCl盐浓度升高到0.3 M和0.5 M，可破坏GPKOW与DHX16蛋白相互结合；
　　7.体内剪接分析显示GPKOW能改善DHX16优势突变体引起的pre-mRNA剪接缺陷，但不能改善呢亚霉素（MMS）引起的pre-mRNA剪接缺陷，GPKOW调控DHX16蛋白功能是特异的；
　　8.GPKOW野生型和G-patch结构域点突变体GPKOW-GW可以部分改善DHX16优势突变体引起的pre-mRNA剪接缺陷，而KOW1结构域点突变体GPKOW-GK失去抑制DHX16优势突变体引起的pre-mRNA剪接缺陷的功能；
　　9.应用纯化的His6-GPKOW融合蛋白作为抗原，皮下注射抗原免疫刺激新西兰雌兔，获得抗全长GPKOW抗体血清；
　　10.Anti-GPKOW抗体可以免疫共沉淀pre-mRNA、中间剪接产物，U1、U2和U6 snRNA；
　　11.应用抗全长GPKOW抗体血清免疫共沉淀法去除HeLaS3 NE中的GPKOW蛋白，导致pre-mRNA剪接缺陷，同时引起剪接体复合物Bact聚集；
　　12.纯化的GPKOW野生型和G-patch结构域点突变体GPKOW-GW回补到去除GPKOW蛋白的HeLaS3 NE中，能够恢复剪接功能，但相同量的KOW1结构域点突变体GPKOW-GK只能相对地部分恢复剪接功能。
　　结论：
　　1.成功构建重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW和pEGFP-C1-GPKOW；
　　2.成功构建重组质粒pET28a(+)/His6-GPKOW-△N，-△C，-△M及-△NC截断突变体；pET28a(+)/His6-GK和-GW点突变体；pEGFP-C1-GK和-GW点突变体。
　　3.结合钴柱和poly（U）琼脂糖珠亲和层析纯化法获得高纯度的His6-GPKOW融合蛋白；
　　4.GPKOW定位于细胞核，为RNA结合蛋白，通过KOW1结构域与RNA结合；
　　5.GPKOW通过G-patch结构域与DHX16蛋白在体外相互结合，这种结合不依赖RNA，且具有盐浓度敏感性；
　　6.GPKOW蛋白在剪接反应中与pre-mRNA、剪接产物及snRNAs相联系；
　　7.GPKOW是人类剪接蛋白及为人pre-mRNA剪接过程所必需；
　　8.GPKOW蛋白在剪接体复合物Bact转变成剪接体复合物C的过程发挥功能；
　　9.GPKOW在pre-mRNA剪接过程，通过KOW1结构域调控DHX16蛋白功能。

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中文摘要

英文摘要

英、汉缩略名词对照表

GPKOW基因克隆和蛋白的表达及纯化第一部分

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

RNA结合蛋白GPKOW调控剪接因子DHX16的功能第二部分

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

GPKOW为人pre-mRNA剪接过程所必需第三部分

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文小结

参考文献

致谢

综述

参考文献