中华蜜蜂泛素结合酶基因AccUBE2N和AccUBE2G1的表达特性与功能分析

摘要

中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是我国特有的优良蜜蜂品种，在促进经济发展和维持生态平衡方面发挥着重要作用。由于对外界刺激较为敏感，中华蜜蜂受环境胁迫影响较大，这制约了中华蜜蜂种群的生存与发展，研究中华蜜蜂的抗逆性能与防御机制对于中华蜜蜂种群的持续健康发展具有重要意义。泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme E2，UBE2）在氧化应激响应、DNA损伤修复和调节免疫反应等多种细胞活动中具有重要功能。本研究以中华蜜蜂为实验材料，分离得到两个泛素结合酶基因，分别命名为AccUBE2N和AccUBE2G1，并对它们进行功能研究，从分子水平上阐述中华蜜蜂抗逆性能与泛素结合酶的联系，主要研究结果如下： （1）对AccUBE2N和AccUBE2G1进行序列分析，结果表明，AccUBE2N的开放阅读框的长度为456bp，编码由151个氨基酸残基组成的蛋白质，预测该蛋白的分子量为17.18kDa，预测等电点为5.72；AccUBE2G1的开放阅读框为507bp，编码由168个氨基酸残基组成的蛋白质，预测分子量为19.28kDa，等电点为4.99。 （2）氨基酸序列比对发现，UBE2N和UBE2G1在不同昆虫中的同源性都较高，它们共有的活性半胱氨酸位点具有高度的保守性。系统进化树分析发现，AccUBE2N和AccUBE2G1都与膜翅目昆虫进化关系更近。三级结构分析表明AccUBE2N和AccUBE2G1具有泛素结合酶家族保守的UBC结构域，且同属Ⅰ类泛素结合酶家族成员。此外AccUBE2G1含有一个能增强结合活性的酸性环结构。 （3）分析AccUBE2N的启动子序列发现，其启动子序列中具有与氧化应激反应有关的转录因子结合位点，说明AccUBE2N可能在调节抗氧化反应中发挥重要作用；同样在AccUBE2G1的启动子序列中含有组织发育相关和细胞应激相关的转录因子结合位点，表明AccUBE2G1可能参与组织特异性发育和应激保护过程。 （4）使用qRT-PCR的方法对两个泛素结合酶基因在不同组织部位的表达特性进行检测。结果发现AccUBE2N和AccUBE2G1在不同组织中均有表达，在肌肉中表达量最高。 （5）通过qRT-PCR检测两个基因在受到不同逆境胁迫后的表达模式，结果表明，在4℃、44℃、UV、H2O2、重金属和杀虫剂的处理下，AccUBE2N和AccUBE2G1被不同程度的诱导表达。以上结果说明，AccUBE2N和AccUBE2G1能响应不同条件造成的细胞应激反应。 （6）运用Western blot的方法进一步研究发现，不同胁迫处理下AccUBE2N和AccUBE2G1蛋白的表达量也被诱导上调，与mRNA水平的变化趋势基本一致。这初步表明，AccUBE2N和AccUBE2G1蛋白可能在中华蜜蜂响应胁迫应激的过程中发挥重要作用。 （7）通过抑菌实验分析AccUBE2N和AccUBE2G1蛋白的体外功能发现，体外表达重组AccUBE2N蛋白可以提高大肠杆菌细胞对重金属或过氧化物的抗性；而AccUBE2G1蛋白对细菌的生长具有一定的抑制作用。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1中华蜜蜂的生物学特性及重要地位

1.2中华蜜蜂的现状及面临的不良环境胁迫

1.3生物体内的氧化应激

1.4泛素化系统

1.4.1泛素化系统的功能

1.4.2泛素化系统的组成部分

1.5泛素结合酶概述

1.5.1泛素结合酶的命名

1.5.2泛素结合酶的结构特征

1.5.3泛素结合酶的功能

1.6泛素结合酶UBE2N

1.6.1 UBE2N与氧化应激

1.6.2 UBE2N与免疫反应

1.6.3 UBE2N与DNA损伤修复

1.6.4 UBE2N与癌症

1.7泛素结合酶UBE2G1

1.7.1 UBE2G1与内质网相关性降解

1.7.2 UBE2G1与应激保护

1.7.3 UBE2G1与其它

1.8研究目的与意义

2 材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1蜜蜂材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶与各种生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.1.5培养基

2.2实验方法

2.2.1中华蜜蜂的饲养管理与实验处理

2.2.2中华蜜蜂总RNA的提取

2.2.3 cDNA的合成

2.2.4目的基因开放阅读框的分离

2.2.5目的DNA片段的琼脂糖凝胶回收

2.2.6目的DNA片段与克隆载体的连接反应

2.2.7大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.8连接产物的转化

2.2.9大肠杆菌质粒的提取与酶切鉴定

2.2.10实时荧光定量PCR对基因表达的分析

2.2.11目的基因原核表达载体的构建与诱导表达

2.2.12抗体的制备

2.2.13 Western blot分析

2.2.14抑菌实验分析

2.2.15数据库与网络资源

2.2.16生物学软件

3 结果与分析

3.1中华蜜蜂AccUBE2N基因的分离与生物信息学分析

3.1.1 AccUBE2N开放阅读框的分离与序列分析

3.1.2AccUBE2N基因组结构分析

3.1.3 AccUBE2N氨基酸序列分析

3.1.4 AccUBE2N的启动子区域顺式作用元件预测

3.1.5 AccUBE2N基因的表达特性分析

3.1.6重组AccUBE2N蛋白的原核表达

3.1.7 AccUBE2N在不同胁迫条件下的蛋白表达分析

3.1.8重组AccUBE2N蛋白的抑菌实验分析

3.2中华蜜蜂AccUBE2G1基因的分离与生物信息学分析

3.2.1 AccUBE2G1开放阅读框的分离与序列特征分析

3.2.2AccUBE2G1基因组结构分析

3.2.3 AccUBE2G1氨基酸序列分析

3.2.4 AccUBE2G1的启动子序列顺式作用元件预测

3.2.5 AccUBE2G1基因的表达特性分析

3.2.6重组AccUBE2G1蛋白的诱导表达

3.2.7 AccUBE2G1在不同胁迫条件下的蛋白表达分析

3.2.8重组AccUBE2G1蛋白的抑菌实验分析

4 讨论

（1）AccUBE2N和AccUBE2G1具有保守的结构域和活性位点

（2）AccUBE2N和AccUBE2G1基因在肌肉中高表达

（3）AccUBE2N和AccUBE2G1从转录水平响应各种胁迫产生的应激

（4）AccUBE2N和AccUBE2G1的蛋白表达水平响应多种胁迫应激

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文及成果