敲除根瘤中特异表达基因对蒺藜苜蓿结瘤的影响

摘要

蒺藜苜蓿是豆科一年生草本植物，具有倍性小、基因组小、自花受粉及结种较多等特点。蒺藜苜蓿的植株再生时间较短，具有较高的遗传转化效率，因此其作为一种模式植物被国内外实验室广泛使用。豆科植物与根瘤菌形成的共生固氮系统是自然界重要的固氮方式之一，豆科植物供给根瘤菌碳水化合物，根瘤菌供给植物氮素养料，从而形成互利共生关系。其本质是一种极其复杂的分子对话行为，其中涉及到一系列豆科植物体内基因的调控表达过程，因此研究与根瘤结瘤固氮相关的基因如何进行表达调控具有重要意义。 本实验室前期利用RNA-Seq对蒺藜苜蓿结瘤根进行研究，发现Medtr3g079850、Medtr8g089360不在发根中表达，只在根瘤中特异表达。推测其在结瘤过程中起到重要的调控作用且可能对蒺藜苜蓿共生固氮产生影响。通过序列比对分析，Medtr3g079850基因推测来自receptor-like protein kinase（受体样蛋白激酶）家族，Medtr8g089360基因推测来自cationic amino acid transporter（阳离子氨基酸转运蛋白）家族。 为进一步探究上述基因在蒺藜苜蓿结瘤过程中的影响，本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除所选基因，观察统计敲除发根与空载发根的表型差异，以及对蒺藜苜蓿结瘤过程的影响，通过qRT-PCR法研究了目的基因在蒺藜苜蓿结瘤过程中的动态表达特征，利用GUS染色确定所选基因翻译产物在根瘤中的表达部位，研究结果将为探明上述基因在蒺藜苜蓿与根瘤菌共生互作过程中所行使的具体功能打下良好基础。 本实验主要研究内容及结果如下： 构建了Medtr3g079850、Medtr8g089360两个基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体；应用发根农杆菌介导的植物受体转化技术，将构建的CRISPR/Cas9基因敲除载体分别导入蒺藜苜蓿，接种根瘤菌后，观察其对蒺藜苜蓿根瘤生长发育的影响。结果显示Medtr3g079850、Medtr8g089360基因被敲除后，与导入空载体的对照组相比敲除发根长度明显减少，结瘤能力减弱，根瘤数量减少，有效根瘤数减少，根瘤小且白。 利用qRT-PCR研究了目的基因在蒺藜苜蓿根瘤生长过程中的动态表达特征，发现Medtr3g079850主要在结瘤前期表达；Medtr8g089360在根瘤发育全过程中表达。 构建了连有Medtr8g089360基因启动子的GUS表达载体，利用GUS染色确定所选基因翻译产物在根瘤中的表达部位，结果显示Medtr8g089360基因翻译产物主要定位于感染区。

目录

声明

1前言

1.1生物固氮的意义

1.2豆科植物与根瘤菌的共生固氮

1.2.1豆科植物

1.2.2根瘤菌

1.2.3根瘤的形成过程

1.2.4根瘤的结构特征

1.2.5根瘤菌中与共生固氮相关的基因

1.2.6豆科植物中早期结瘤信号的传导过程

1.2.7阳离子氨基酸转运蛋白

1.2.8受体样蛋白激酶

1.3发根农杆菌介导的植物转化技术

1.3.2植物转化技术

1.3.3发根农杆菌介导的毛状根应用

1.4基因编辑技术

1.4.1基因编辑技术发展历程

1.4.2锌指核酸酶（ZFN）

1.4.3转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）

1.4.4 CRISPR/Cas9技术

1.4.5几种基因编辑技术精准度与效率比较

1.4.6基因编辑技术的应用

1.4.7基因编辑技术的前景与局限

1.5研究目的与意义

1.6技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒与菌株

2.1.2植物材料

2.1.3培养基及试剂配方

2.2 实验方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 PCR反应体系（20μL）及反应条件

2.2.3 PCR扩增产物的回收

2.2.4大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）及转化

2.2.5农杆菌电转化感受态细胞的制备及转化

2.2.6提取质粒

2.2.7试剂盒提取蒺藜苜蓿总RNA

2.2.8蒺藜苜蓿总RNA纯化及反转录

2.2.9目的基因表达的qRT-PCR分析

2.2.10 GUS表达载体的构建

2.2.11 CRISPR/Cas9敲除载体的构建

2.2.13发根农杆菌介导的蒺藜苜蓿转化体系的建立

3结果与分析

3.1目的基因序列分析

3.1.1 Medtr3g079850基因序列分析

3.1.2 Medtr8g089360基因序列分析

3.2蒺藜苜蓿根瘤cDNA的提取

3.2.1根瘤总RNA的提取

3.2.2总RNA的反转录

3.3 载体的构建

3.3.1 CRISPR/Cas9敲除载体构建

3.3.2 GUS染色载体构建

3.4 基因敲除表达结果

3.4.1敲除植株发根RFP基因的检测

3.4.2敲除植株根瘤GFP基因的检测

3.4.3 目的基因的敲除位点检测

3.4.4目的基因的表达效率检测

3.4.5转基因植株的表型观察与统计

3.4.6 根瘤形态对比

3.5 GUS染色结果

4讨论

5结论

参考文献

附录

本实验所用引物

目的基因测序序列

致谢