PDM1单碱基突变调控拟南芥低温响应的机理研究

摘要

低温作为最主要的非生物胁迫之一,不仅限制植物的地理分布和生长发育,也是影响农作物产量的重要环境因素.因此研究低温胁迫对植物生长发育的影响,对促进农业生产具有极其重要的意义. PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白是一种RNA结合蛋白,在RNA加工、剪接、成熟、稳定以及植物的生长发育过程中发挥重要功能.拟南芥PDM1编码PLS型的PPR蛋白,参与叶绿体RNA编辑和剪接,但尚未有PDM1参与低温调节的报道.本文对拟南芥PDM1进行了低温条件下的表达分析、功能鉴定和作用机理研究,主要结果如下: (1)我们首先从拟南芥EMS诱变体库中筛选到一株低温(4℃)萌发时子叶黄化的突变体cs1-1.低温条件下cs1-1突变体叶绿素含量显著低于野生型(WT).cs1-1突变体在成苗期和开花期进行低温处理时新生叶和新生花序逐渐黄化,说明cs1-1对低温胁迫敏感.对cs1-1突变体进行高温处理后,cs1-1的存活率显著低于WT,说明cs1-1对高温敏感.但cs1-1突变体在盐胁迫、甲基紫精(MV)和ABA处理后的表型与WT一致.表明pdm1-1特异地对极端温度敏感. (2)通过图位克隆对cs1-1突变基因进行精细定位和测序验证,发现cs1-1突变基因为编码PPR蛋白的PDM1(AT4G18520)上一个C到T的单碱基突变,造成第491位的丝氨酸(S)突变为亮氨酸(L).因此将cs1-1更名为pdm1-1.将pdm1-1与其T-DNA插入突变体pdm1-2杂合株系进行杂交.杂交F1代种子在低温条件下萌发时有1/2的植株子叶黄化,进一步确定了PDM1基因突变. (3)利用半定量RT-PCR对PDM1进行组织表达分析,发现PDM1在拟南芥莲座叶、茎生叶、茎、花、根、发育的果荚和种子中均有表达,在茎生叶和种子中表达水平较高.同时对PDM1进行低温诱导表达分析,结果显示PDM1的表达量在低温处理24h内随时间延长而显著增加. (4)利用qRT-PCR对低温信号标志基因进行表达分析,结果发现低温处理后CBF1,CBF2,CBF3及其靶基因COR15A和COR413在pdm1-1中的诱导表达远低于WT,表明PDM1在低温条件下正调控CBF信号途径. (5)将低温胁迫处理的植株转移至正常生长条件下培养,突变体能够迅速恢复绿色,其叶绿素含量也上升至野生型水平.对叶绿素前体含量进行检测,发现正常条件下pdm1-1的叶绿素合成关键组分含量与WT一致,但在低温条件下pdm1-1的Urogen III和Mg-Proto IX含量显著高于WT,而Pchlide和Chl.a含量显著低于WT,说明低温胁迫下PDM1调控Mg-Proto IX向Pchlide的转化.对上述组分的合成基因进行半定量RT-PCR分析,发现相关基因在pdm1-1中的表达与WT一致,表明PDM1通过非转录水平调控叶绿素合成. (6)进一步分析发现突变体幼苗在低温胁迫处理后淀粉积累减少,光系统II保护蛋白D1和光合作用蛋白RbcL的表达水平显著低于野生型,表明PDM1能够在低温胁迫下调控D1和RbcL的蛋白水平,从而维持叶绿体功能. (7)利用原生质体对低温胁迫下的PDM1进行亚细胞定位分析,发现低温胁迫不改变PDM1的叶绿体定位.酵母双杂交和pull-down实验显示CPNA2可以与PDM1、MORF2和MORF8互作,而前人的研究表明PDM1可以与MORF2和MORF8互作.因此,PDM1可能通过与MORFs和CPNA2形成复合体调控D1和RbcL等叶绿体蛋白稳定.

目录

声明

符号说明

1前言

1.1低温胁迫对植物的影响

1.2低温信号转导途径

1.2.1低温信号感知

1.2.2从细胞膜至细胞核的低温信号转导

1.2.3植物细胞发育与防御之间的平衡

1.3叶绿素的合成与调控

1.3.1叶绿素的合成

1.3.2叶绿素生物合成的调控

1.3.3叶绿素的功能

1.4 PPR蛋白家族

1.4.1 PPR蛋白的分布

1.4.2 PPR蛋白的结构特征与分类

1.4.3 PPR蛋白的功能

1.5 PDM1的研究进展

1.6本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和载体

2.1.3酶及生化试剂

2.1.4引物

2.2实验方法

2.2.1 CTAB法提取植物基因组

2.2.2植物RNA的提取、纯化和反转录

2.2.3转录水平表达量的检测

2.2.4相关载体的构建

2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.6农杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.7植物材料的遗传转化及鉴定

2.2.8拟南芥原生质体的制备

2.2.9叶绿素含量的测定

2.2.10 叶绿素前体含量的测定

2.2.11 淀粉的染色

2.2.12 蛋白免疫印迹

2.2.13 酵母双杂交

2.2.14 蛋白表达及纯化

2.2.15 蛋白质体外结合实验

3结果与分析

3.1低温敏感突变体的筛选

3.2 cs1-1突变体成苗期表型分析

3.3利用图位克隆技术分离目的基因

3.4 PDM1的表达模式分析

3.5 PDM1在低温胁迫下正调控CBF信号途径

3.6 PDM1在低温胁迫下调控叶绿素合成

3.7 PDM1在低温胁迫下维持叶绿体功能

3.8 PDM1的亚细胞定位分析

3.9 PDM1可能通过与MORFs和CPNA2形成复合体发挥作用

4讨论

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况