小麦不同灌浆期粒重基因的条件QTL定位及基因敲除载体的构建

摘要

小麦（Triticum aestivumL.）是世界性的粮食作物，小麦产量的增长和品质的提高一直是小麦育种学家和研究者关注的重点。小麦粒重是由微效多基因控制的数量性状，小麦籽粒产量形成的关键时期集中在灌浆期，且在不同灌浆时期会有不同基因的进行表达，从而最终影响小麦产量。本研究以亲本“山农01-35×藁城9411”构建的包含173个家系的RIL群体（F8:9）和205份黄淮海麦区小麦品种（系）组成的自然群体为材料，利用实验室已构建完成的高密度遗传图谱，在不同灌浆时期，对小麦千粒重进行QTL定位和全基因组关联分析。利用生物信息学手段对主效的千粒重QTL进行候选基因预测，并构建了CRISPR-Cas9敲除载体，为粒重基因的精细定位和图位克隆奠定基础。本研究的主要结果如下： （1）在4个不同的籽粒灌浆期，共检测到35个千粒重的非条件QTL，分别位于染色体1A、1B、2A、2B、3A、3B、3D、4A、4B、5B、5D、7A和7B上，可解释3.72%-12.97%的表型变异率。QTKW4B.4-17,QTKW4B.2-13和QTKW3A.4-42在灌浆第三时期和第四时期同时被检测到，是控制粒重的主效QTL。位于TaTkw_4B-Rht1区间内的TKWd4B.4-17在不同环境下都被检测到，是一个稳定的基因位点。 （2）以不同灌浆时期为条件，利用条件QTL检测方法，解析了粒重性状QTL动态水平上的遗传机理，共检测到22个控制千粒重的条件QTL，其中有7个在条件和非条件QTL中被共同检测到。分析结果表明，TKWb7A.1-69,TKWb1B.1-4,TKWc1A.3-83,TKWc3A.4-42,TKWc4B.2-13,TKWd4B.4-17和TKWd2B.6-45是稳定表达的基因位点。 （3）在三个环境中共检测到104个千粒重的显著关联位点，除了1D、3D、4D和7D染色体外，在其他17条染色体上都有粒重关联位点，表型变异率在5.79%-12.55%之间。在1B、4B、和7A染色体上，检测到26个与千粒重显著关联的标记，表型变异率在5.98%-9.14%之间。位于2B染色体的wsnp_Ex_rep_c103064_88104690和连锁分析中定位到的QTKWd2B.8-3的遗传距离仅为3.8cM；与4B染色体上的wsnp_Ex_c23363_32607637在多时期、多环境下同时检测到，说明关联到的两个位点可以有效控制粒重。 （4）利用中国春小麦基因组对控制粒重的QTL位点QTKW4B.4-17进行分析，检测发现QTKW4B.4-17的两端标记的遗传距离是2.3cM，物理距离相距1.91Mb，区间内包含9个具有注释功能的高置信基因。 （5）成功构建目标区段内高置信基因TraesCS4B01G042300的敲除载体Sg2300-001，为后续实验中实现靶基因的敲除，以及目标区段粒重基因的鉴定筛选提供参考依据。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 小麦灌浆期粒重的研究进展

1.1.1 千粒重的形成因素

1.1.2 小麦粒重相关基因的定位

1.1.3 小麦粒重相关基因的克隆

1.1.4 小麦粒重相关基因的多效性

1.2 分子标记研究进展

1.2.1 分子标记概述

1.2.2 分子标记辅助选择育种（MAS）

1.3 小麦生物信息学发展概述

1.3.1 中国春小麦基因组测序进展

1.3.2 生物信息学研究应用

1.4 基因工程研究进展

1.4.1 基因工程概述及发展

1.4.2 基因工程操作步骤

1.5 CRISPR/Cas9系统研究和应用概述

1.5.1 CRISPR/Cas的基本结构和功能

1.5.2 CRISPR/Cas9的研究进展

1.6本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试小麦

2.1.2 遗传图谱的构建

2.1.3 菌株和质粒

2.2 实验方法

2.2.2 数据分析和QTL定位

2.2.3 PCR扩增反应

2.2.4 胶板的制备与电泳反应

2.2.5 生物信息学分析

2.2.6 DH5α的转化

2.2.7 质粒提取方法

2.2.8 单链合成双链

2.2.9 酶切及连接反应

3 结果与分析

3.1 RIL群体不同灌浆时期粒重相关性状的连锁分析

3.1.1 不同灌浆期粒重相关性状的表型分析

3.1.2 籽粒相关性状的相关性分析

3.1.3 RIL群体QTL非条件连锁分析

3.1.4 RIL群体QTL动态条件连锁分析

3.2 自然群体不同灌浆时期粒重的关联分析

3.2.1 自然群体不同灌浆期表型值分析

3.2.2 自然群体粒重性状位点的关联分析

3.3 QTKW4B.4-17候选基因的的预测

3.4 基因敲除载体的构建

4 讨论

4.1 灌浆期粒重的发育

4.2 高密度遗传图谱的应用

4.2.1 小麦灌浆期控制粒重的连锁分析

4.2.2 小麦灌浆期控制粒重的关联位点

4.3 小麦基因组生物信息学分析

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况