山东省某地方品种鸡ALV-K的分离鉴定及其全基因组序列分析

摘要

山东寿光鸡群中的ALV感染较为严重，对其进行了检测，毒株的分离鉴定、基因组特征分析以及多克隆抗体的制备等研究。 从该鸡群采集样品，经ALV p27抗原ELISA检测，阳性率为54%。阳性血浆接种DF-1细胞，提细胞基因组cDNA，用ALV特异性引物经PCR扩增env基因，与国内外A、B、C、D、E、J亚群参考株同源性为57.1%~93.2%，其中，与内源性E亚群参考株为93.2%，由于DF-1细胞可以抗内源性病毒，所以可以排除E亚群；与K亚群参考株的核苷酸为94.1%~99.4%，进化树分析显示，10个分离株与K亚群参考株亲缘关系最近，因此，初步确定为ALV-K，分别命名为hz01~hz10。 根据遗传关系，选取3个不在同一分支上的分离株，将感染该病毒的鸡解剖后，表观未看到症状，病理组织观察发现，肝脏、脾脏、卵巢、肺脏、肾脏均有不同程度的淋巴细胞浸润和出血，其中心脏最为严重，出现了部分细胞变性坏死；超微结构病理变化为，肝脏和脾脏中出现淋巴细胞核膜褶皱，胞质中含有液泡，见到多个大小为200nm左右的病毒粒子，肝脏中形成淋巴小结。将hz01、hz04、hz06毒株进行全基因组测序，其前病毒cDNA全基因组序列长度分别为7482bp、7491bp、7478bp，与K亚群参考株相比，除R区外，其余基因均有不同程度的增长或缩短。gag、pol、gp37基因及R、U5区与大多参考毒株核苷酸序列同源性都在95%以上，而gp85基因、U3区差异显著。3个分离株的gp85和gp37核苷酸均为1005bp、612bp，编码相应的氨基酸序列大小分别是：335aa、204aa。分离株之间的gp85核苷酸同源性为97.2%~99.0%，氨基酸同源性为95.2%~98.8%；与国内外各个K亚群参考株核苷酸同源性为94.7%~99.4%，氨基酸同源性为91.3%~99.6%，与GDFX0602、GDFX0603的氨基酸同源性最高，与HB2015032、JS11C1同源性最低，虽均为ALV-K，分离株间的gp85氨基酸序列存在较小的差异，而与各个K亚群参考株存在不同程度差异，主要表现在个别位点的突变，没有插入、缺失等变化，这些氨基酸突变可能会使蛋白质结构发生变化。LTR长度分别为276bp、280bp、276bp，与内源性病毒相似，同源性最高为95.3%~98.2%，与外源性病毒较低为58.5%~64.3%。与K亚群相比，其长度差别主要表现在U3区，变异也主要出现在该区，分离株之间的核苷酸同源性为97.2%~98.9%，与国内外参考株同源性为36.4%~100%，从遗传进化树上来看，与HB2015032、Sp-53、JS11C1、JS14CZ01亲缘关系最远，变异较大，碱基插入、缺失、突变较多。3个分离株的全基因序列与GDFX0601，GDFX0602和GDFX0603参考株同源性极高，虽从不同地区分离出来的，但可能从同一毒株变异而来，而与HB2015032、Sp-53、JS11C1、JS14CZ01的同源性较低，均为不同的进化背景。ALV-K可能已经存在于山东本地鸡群中很长一段时间，具有毒株多样化趋势。因此，加强对ALV-K生物学特性的深入分析，了解不同地区ALV-K的变异差异，将有益于中国本土鸡的ALV根除计划。 用ALV-K-gp85特异性引物，经PCR扩增出1002bp大小的ALV-K-gp85基因片段，建立重组质粒pET-32a-ALV-K-gp85，转化到大肠杆菌BL21中，经可溶性分析，该蛋白主要以包涵体的形式存在，用Ni-NTA亲和层析介质对其纯化，进行SDS-PAGE和Western分析，出现了1条相对分子量为53kD左右的条带，BCA法测得的蛋白浓度为3.1436ug/uL。纯化后的蛋白作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体。经ELISA方法检测，抗体效价达到1：12800，进行IFA检测，制备的多克隆抗体可识别ALV-K感染。为制备亚单位疫苗和建立快速检测方法奠定了基础，为今后防控、净化该病提供可能。 综上，分离得到10株ALV-K。hz01、hz04、hz06分离株变异主要表现在gp85基因和U3区上，gag、pol、gp37基因以及U5、R区比较保守。成功表达并纯化了ALV-K-gp85蛋白，并得到了其多克隆抗体。

目录

声明

符号及缩略词说明

前言

1.1 ALV病原学

1.1.1 ALV结构特征

1.1.2 ALV理化特性

1.1.3 ALV基因组结构与功能

1.1.4 ALV的结构蛋白

1.2 ALV的临床症状及病理变化

1.3 ALV的研究进展

1.4 ALV的检测与诊断

1.5 ALV的预防与控制

1.6研究的目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1样品

2.1.2细胞

2.1.3实验动物

2.1.4菌株、质粒

2.1.5主要试剂

2.1.6主要溶液的配制

2.1.7主要试验仪器

2.1.8 ALV不同亚群同源性比较的参考毒株

2.2试验方法

2.2.1泄殖腔棉拭子p27抗原检测

2.2.2感染ALV-K鸡的病理组织切片制备

2.2.3超薄切片制备

2.2.4病毒分离与鉴定

2.2.5前病毒cDNA的提取

2.2.6引物设计与合成

2.2.7分离毒株亚群鉴定及序列分析

2.2.8 ALV-K-gp85基因的原核表达

2.2.9 ALV-K-gp85多克隆抗体的制备

3结果与分析

3.1 ALV p27抗原ELISA检测结果

3.2 ALV分离株env基因扩增结果

3.3 ALV分离株env基因序列同源性分析

3.4感染ALV-K鸡的病理组织学观察结果

3.5超微病理学观察结果

3.6 ALV-K分离株目的基因扩增结果

3.7 hz01、hz04、hz06前病毒全基因组序列遗传进化分析

3.7.1前病毒全基因组序列长度比较

3.7.2 gp85与gp37基因序列分析

3.7.3 gag基因序列分析

3.7.4 pol基因序列分析

3.7.5 LTR区序列分析

3.8 ALV-K-gp85基因的原核表达结果

3.8.1 PCR扩增结果

3.8.2 pET-32a-ALV-K-gp85重组质粒PCR鉴定与测序结果

3.8.3 pET-32a-ALV-K-gp85蛋白的诱导表达结果

3.8.4 pET-32a-ALV-K-gp85蛋白的可溶性分析

3.8.5 pET-32a-ALV-K-gp85蛋白的纯化及浓度分析

3.8.6 pET-32a-ALV-K-gp85蛋白的Western blot分析

3.9 ALV-K-gp85多克隆抗体特性检测结果

3.9.1效价检测结果

3.9.2间接免疫荧光检测结果

4讨论

5结论

参考文献

致谢