日本沼虾衔接蛋白Syntenin和ADP核糖基化因子2基因的分子克隆及其表达分析

摘要

日本沼虾（Macrobrachium nipponinse）是我国淡水养殖中重要的经济虾类之一。随着集约化的养殖，环境胁迫成为日本沼虾养殖过程中的关键问题，而氨氮是水产养殖中最重要的环境胁迫因子之一，能够严重影响水产动物生长发育与生理健康。因此研究日本沼虾抗氨氮胁迫的分子机制尤为重要。 衔接蛋白Syntenin（MnSyn）是普遍存在于真核生物及原核生物中的胞内衔接蛋白（adaptor proteins），在细胞免疫和信号转导等细胞活动中发挥重要作用。ADP核糖基化因子2（MnArf2）是Ras基因超家族中的成员，能够调节磷脂酶D的活性，在物质运输和信号转导过程中发挥重要作用。本试验以日本沼虾为实验材料，采用RACE克隆、实时荧光定量PCR、Western blot和酶活测定等技术，对MnSyn、MnArf2基因进行了克隆鉴定和基因表达与功能检测，同时对高浓度氨氮胁迫下日本沼虾抗氧化酶的相关变化进行了测定。主要研究结果如下： 首先在实验室条件下，通过对日本沼虾进行氨氮胁迫试验得到其半数致死浓度LD50（48h）为96.8mg/L。酶活性测定显示，氨氮胁迫初期日本沼虾肝胰腺、鳃和肌肉组织的总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）均出现显著的上升趋势。在胁迫后期T-AOC和SOD出现明显的下调，说明机体的抗氧化酶活性受到明显的抑制。丙二醛（MDA）的含量在胁迫初期无明显变化，胁迫24h后MDA的水平显著高于对照组，且出现逐渐上升的趋势，表明日本沼虾的组织细胞受损程度逐渐严重。 通过分子克隆和RACE技术，获得了长度为2432bp的日本沼虾MnSyn基因cDNA全序列。其中包含62bp的5′UTR、1475bp的3′UTR和957bp的CDS区，其中开放阅读框编码为318个氨基酸组成的蛋白质，预测该蛋白分子量为34.26KDa。该基因编码的蛋白质有两个串联存在的PDZ结构域。同源性比较分析发现MnSyn与凡纳滨对虾、斑节对虾和日本囊对虾Syntenin基因的相似性均较高，分别依次是78％、77％和75％，在进化过程中比较保守。日本沼虾MnArf2基因全长为949bp，包含264bp的5′UTR、148bp的3′UTR以及537bp的CDS区，其中537bp开放阅读框编码为178个氨基酸组成的蛋白质，预测该蛋白分子量为19.98KDa。序列比对分析发现，MnArf2与日本对虾Arf相似性70％，与凡纳滨对虾Arf-like相似性69％。MnArf2含有典型的Switch、Interswitch区和Ploop区。Switch、Interswitch区参与调节Arf分子在GDP/GTP间相互转化，这些结构均能够反映出MnArf2在进化上是高度保守的。 荧光定量检测结果显示，在氨氮胁迫后的8个时间点（0h,3h,6h,12h,24h,48h,72h,96h），日本沼虾MnSyn基因和MnArf2基因在各组织的表达量均发生了明显的变化。氨氮胁迫6h后MnSyn基因的表达量开始上升，在24h处表达量达到峰值，之后开始下降，72h后仍与对照组有显著差异。MnArf2在氨氮胁迫后6h表达量显著上调，胁迫12h处达到峰值，之后开始下调，72h后逐渐恢复到初始水平。Western Blot结果表明，MnSyn蛋白在日本沼虾的肝胰腺、鳃、肌肉、心、胃和眼柄中均有表达。且在肝胰腺和鳃组织中的表达量最高，眼柄和胃组织中的表达量较低，差异显著（P＜0.05）。 综合分析试验结果，氨氮胁迫后日本沼虾MnSyn和MnArf2基因均出现显著的上调表达，在肝胰腺、鳃以及心组织中表达量较高，表明MnSyn和MnArf2基因与日本沼虾受氨氮胁迫产生的免疫应答反应有关。本研究为进一步揭示日本沼虾抗氨氮胁迫的分子机制奠定了重要基础，同时也为日本沼虾的健康养殖提供了科学依据。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1日本沼虾的生物学特征及其养殖现状

1.2水体中氨氮的来源及其危害

1.2.1水体中氨氮的来源

1.2.2氨氮对甲壳动物的危害

1.2.3甲壳动物受氨氮胁迫后的解毒代谢机制

1.3甲壳动物的免疫系统

1.3.1物理防御

1.3.2细胞免疫

1.3.3 体液免疫

1.3.4甲壳动物体内的抗氧化酶类

1.4 Syntenin的研究进展

1.5ADP核糖基化因子（ADP ribosylation factor）的研究进展

1.6快速克隆cDNA末端技术（rapid amplification of cDNA ends, RACE）

1.7本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验动物

2.1.2主要仪器和设备

2.1.3主要试剂

2.1.4常用溶液配置

2.1.5主要数据库及生物软件

2.2试验方法

2.2.1纳氏试剂法测定试验用水氨氮含量

2.2.2氨氮胁迫试验

2.2.3引物合成

2.2.4日本沼虾总RNA的提取

2.2.5反转录合成cDNA与检测

2.2.6 RACE扩增目的基因全长cDNA序列

2.2.7 PCR产物片段回收

2.2.8 PCR产物与载体的连接

2.2.9大肠杆菌的转化及测序

2.2.10 生物信息学分析

2.2.11 荧光定量PCR

2.3 MnSyn和MnArf2基因的原核表达和蛋白纯化

2.3.1 MnSyn表达载体的构建及菌株的转化表达

2.3.2 MnArf2表达载体的构建及菌株的转化表达

2.3.3重组蛋白的小试表达

2.3.4表达产物的SDS-PAGE检测

2.3.5重组蛋白的大量表达及蛋白纯化

2.3.6 总蛋白的提取

2.3.7 日本沼虾MnSyn基因蛋白的Western-blot 检测

2.4抗氧化酶活力的测定

2.4.1样品制备

2.4.2测定方法

3 结果与分析

3.1 RNA的提取质量检测

3.2 MnSyn基因试验结果

3.2.1 MnSyn基因cDNA的克隆及序列分析

3.2.2 MnSyn基因的同源性比对分析

3.2.3MnSyn基因的mRNA表达水平分析

3.2.4 MnSyn的重组表达及在各组织中的表达

3.3 MnArf2基因试验结果

3.3.1 MnArf2基因cDNA的克隆及序列分析

3.3.2 MnArf2基因的同源性比对分析

3.3.3 MnArf2基因mRNA表达水平分析

3.3.4 MnArf2的重组表达

3.4抗氧化酶活力的变化

4讨论

4.1日本沼虾MnSyn基因的结构、功能及其表达分析

4.1.1日本沼虾MnSyn基因的结构与功能分析

4.1.2日本沼虾MnSyn基因的表达分析

4.2日本沼虾MnArf2基因的结构、功能及其表达分析

4.2.1日本沼虾MnArf2基因结构与功能分析

4.2.2日本沼虾MnArf2基因的表达分析

4.3氨氮胁迫对日本沼虾抗氧化能力的影响

5结论

参考文献

致谢