嗜热革节孢AA9家族多糖单加氧酶氧化产物的鉴定

摘要

纤维素和几丁质是地球上最丰富的两类生物质资源，在转化成清洁能源方面具有巨大的应用潜力，同时这也对解决目前的能源短缺、环境污染等问题有着重大意义。传统的对于纤维素和几丁质的清洁利用是通过糖苷水解酶降解完成的，但是糖苷水解酶对于底物结晶区域的催化效率很低，严重限制了生物质的高效利用。 近年来，科学家发现了一类新的纤维素降解酶，铜离子依赖的多糖单加氧酶（Polysaccharide Monooxygenases,PMOs），属于辅助活性酶类第九家族（auxiliary activity9，AA9），在存在电子供体维生素C（vitamin C，Vc）的情况下，可以氧化裂解纤维素的多糖链，显著提高纤维素的酶解效率，引起人们的广泛关注。 本研究从嗜热革节孢菌中克隆了AA9家族PMO酶基因pmo7651，并在毕赤酵母中成功表达获得了PMO7651酶。利用薄层层析（TLC）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、饱和溴水氧化、定点突变等方法，进行了酶活性测定、酶解产物组分鉴定、氧化方式的确定、底物结合平面芳香族氨基酸对酶活性和酶解产物组分的影响，此外还测定了PMO7651酶对其它纤维素酶的协同作用。 将PMO7651酶与不溶性底物磷酸膨胀纤维素（PASC）在pH5.0、50℃、200rpm条件下反应48h。TLC结果显示随着反应时间的增加，产物的生成量逐渐增多，且反应产物主要为纤维二糖至纤维五糖。MALDI-TOF-MS结果显示，PMO7651酶解产物中除含有非氧化型纤维寡糖外，还存在氧化型的纤维寡糖。其中氧化型纤维寡糖含有C1、C4或C6位的氧化寡糖，但因C4位和C6位氧化产物具有相同的质谱峰值，需要通过其它方法进一步鉴定。为了进一步确定区分PMO7651的C4或C6位的氧化，将酶解产物利用饱和溴水氧化后进行MALDI-TOF-MS分析，检测到m/z+14、m/z+28和m/z+30的峰值，确定PMO7651同时存在C1、C4、C6位氧化。 为了研究PMO7651底物结合平面上的芳香族氨基酸Tyr40、His171、Phe181对酶活性及其产物的影响，对这三个点进行定点突变，获得了三个突变酶。将突变酶进行酶解反应，TLC结果显示Tyr40和Phe181可检测到反应生成的寡糖，而His171并未检测到明显的产物。MALDI-TOF-MS分析显示：Tyr40保留了部分的C1、C4/C6位的氧化活性，His171丧失了C4/C6位的氧化，Phe181基本上保留了C1、C4/C6位的氧化。由此说明底物结合平面的3个芳香族氨基酸位点突变对酶的活性具有不同程度的影响。 选取3种不同的纤维素酶测定PMO7651对纤维素酶的协同作用，结果显示PMO7651对EG1的降解效率提高了约1.03倍；同样对CBH1的降解效率提高了约0.42倍；对BGL1的降解效率提高了约0.18倍，由此表明PMO7651酶对不同纤维素酶具有不同程度的提高。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1纤维素的概述

1.1.1纤维素

1.1.2 木质纤维素

1.2纤维素酶的概况

1.2.1纤维素酶的组成

1.2.2 纤维素酶的降解

1.3多糖单加氧酶的研究进展

1.3.1多糖单加氧酶概述

1.3.2 多糖单加氧酶结构

1.3.3 多糖单加氧酶的催化机理

1.3.4多糖单加氧酶的区域选择性

1.3.5 多糖单加氧酶的底物特异性

1.3.6 多糖单加氧酶与植物的相互作用

1.4 嗜热真菌的研究概况

1.5 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1实验菌株

2.1.2 试验试剂、试剂盒和酶

2.1.3 培养基及溶液的配置

2.2 实验方法

2.2.1 嗜热革节孢总RNA以及cDNA的获得

2.2.2 PMO7651野生酶的真核表达

2.2.3 PMO7651突变酶的表达和纯化

2.2.4 PMO7651酶活性以及酶解产物的鉴定

2.2.5 PMO7651野生酶与纤维素酶的协同作用

3 结果与分析

3.1 总RNA、cDNA的获得

3.2 PMO7651野生酶的真核表达

3.2.1 pmo7651基因的获得

3.2.2 pPICZaA-pmo7651重组质粒的构建

3.2.3 PMO7651野生酶工程菌的筛选及验证

3.2.4 PMO7651野生酶的诱导表达及纯化

3.3 PMO7651突变酶的真核表达

3.3.1 PMO7651酶的三维结构模型

3.3.2 PMO7651突变基因的获得

3.3.3 PMO7651突变酶工程菌的筛选及验证

3.3.4 PMO7651突变酶的诱导表达及纯化

3.4 PMO7651野生酶酶活性及酶解产物的分析

3.4.1 PMO7651野生酶酶解产物的TLC分析

3.4.2 PMO7651野生酶酶解产物的MALDI-TOF-MS分析

3.4.3 PMO7651野生酶酶解产物的溴氧化分析

3.5 PMO7651突变酶酶活性及其酶解产物的分析

3.5.1 PMO7651突变酶酶解产物的TLC分析

3.5.2 PMO7651突变酶酶解产物的MALDI-TOF-MS分析

3.6 PMO7651野生酶与纤维素酶的协同作用分析

4讨论

4.1 饱和溴水氧化的优势

4.2 C6的催化机制及其氧化产物的去向

4.3底物结合平面芳香族氨基酸位点突变对酶活性的影响

4.4 PMO7651野生酶与纤维素酶的协同作用

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况