皱皮木瓜种质药用成分对遮荫和套袋技术的响应及转录组学分析

摘要

皱皮木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠（Chaenomeles speciosa），皱皮木瓜具有极高的药用营养价值，是保健食品和中药的重要来源。本研究通过分析不同种质间皱皮木瓜主要药用成分（齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸）的含量，以及测定了部分微量元素的含量，对皱皮木瓜药用价值进行综合分析与评价，探讨并筛选了皱皮木瓜优质种质资源；其次利用遮荫和套袋技术手段探究其对皱皮木瓜果实中药用成分的调控影响，为提高皱皮木瓜的药用价值提供了试验基础。进而通过皱皮木瓜转录组测序数据、挖掘绿原酸生物合成途径中的关键基因，为今后深层次开发皱皮木瓜基因提供了重要的科学依据，同时为皱皮木瓜深度研究与资源的开发利用积累试验材料。本研究主要结果如下： 1.采用高效液相色谱法测定了皱皮木瓜果实中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸四种化学成分。测定结果显示，齐墩果酸含量最高，高达8.024mg·g-1；其次是绿原酸，高达5.662mg·g-1；同时各种质间含量差异较大，齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸变异系数分别为44.30%、28.67%、32.27%、39.58%。14个种质(M1-M14)中四种成分含量之和最高的是M13（15.530mg·g-1），最低的是M6(4.281mg·g-1)。 2.利用火焰原子吸收法测定Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg六种微量元素含量。结果显示，14个种质均含有较多人体必需的微量元素，其中Ca元素的含量远高于其它元素，其次是Mg元素，Fe、Mn、Zn次之，Cu含量最低。其中六种元素含量之和最高的种质是M4，其Ca元素高达1606.80μg·g-1。不同种质间微量元素含量差异较为明显，Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg元素的变异系数分别为27.12%、28.26%、8.28%、18.33%、23.17%、12.66%。 3.根据齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸和六种微量元素的测定结果，进行了相关性分析和主成分分析。相关性结果显示，Fe元素与齐墩果酸、绿原酸均呈极显著负相关，相关系数分别为-0.881、-0.753；与原儿茶酸呈显著正相关，相关系数为0.725。Zn元素与熊果酸含量呈显著负相关，相关系数为0.555；与原儿茶酸含量成显著正相关，相关系数是0.617。Ca元素与齐墩果酸呈显著负相关，相关系数为-0.579。Fe元素与Zn元素、Mg元素与Ca元素都成极显著正相关；齐墩果酸与绿原酸之间呈显著正相关，与原儿茶酸呈显著负相关，其他含量间相关性并不显著。这表明通过测皱皮木瓜中这六种微量元素的含量，可推测出其四种酸含量的高低。 4.利用遮荫和套袋对皱皮木瓜果实进行试验，旨在探索栽培技术能否提高其药用成分含量。结果表明，通过30天透光70%遮荫处理后，齐墩果酸含量和熊果酸含量明显提高，绿原酸和原儿茶酸的含量则呈降低趋势；经30天套袋处理后，齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和原儿茶酸含量均呈现不同程度的减少；说明套袋方式虽一定程度减少了病虫害、农药残留，但不利于药用成分的合成与积累；总的来看，在皱皮木瓜栽培过程中，可进行适当程度遮荫，使植株更加充分的利用光照，促进有机物质的积累，以达到提高部分药用成分的目的。 5.本试验利用Illumina sequencing测序平台对皱皮木瓜果实部位进行转录组测序，共获得105,236,920条读段(Reads），过滤后得到的有效读段数据(clean reads）有102,531,308条，占比97.40%，2个样品的高质量clean reads比例均达97%以上；用Trinity对clean reads进行拼接，获得非冗余的基因(unigene）数据109211条，GC含量为46.95%，Q30均大于93%，平均长度为1492bp，N50为1963bp。将这些unigenes序列进行了七大数据库的基因功能注释，包括：Nr，Nt，Pfam，COG/KOG，Swiss-prot，KO，GO。共有109211条Unigenes获得功能注释。GO数据库注释显示63658条unigenes（58.28%）被注释到生物过程、细胞组分、分子功能3个大类，25个子类；有27866条unigenes（25.51%）被注释到了KOG数据库26个功能分类中，其中注释unigenes数量最多的是翻译后修饰，蛋白质转换，分子伴侣功能；以KEGG数据库为依据，将27478条unigenes注释到到129条代谢途径中，其中unigene最多的途径是碳代谢。这为皱皮木瓜分子生物学研究提供了一定数据支撑。 6.在M6vs.M8转录组分析中，一共有4254个差异表达基因，其中包括2388个上调基因和1866个下调基因。总共有3313个差异表达基因被分配到分子功能、细胞组分和生物学过程的三大GO分类和41个功能子类中，其中上调表达差异基因有1405条，下调表达差异基因有1908条；将差异表达基因与KEGG数据库的代谢通路进行比对，共有1938条Unigenes注释到114个代谢通路，其中富集最多的KEGG通路是植物激素信号转导。 7.绿原酸合成于苯丙烷生物合成途径中，在皱皮木瓜转录组中涉及绿原酸合成的相关酶有四种，分别是苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanin ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸径基化酶(cinnamate4-hydroxylase,CYP73A)、香豆酸-Co A连接酶（4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4CL）和莽草酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)；其中M6vs.M8涉及绿原酸合成途径的差异表达基因有6条，4条上调表达（Cluster-4.63242；Cluster-4.1656；Cluster-4.15617；Cluster-4.9557），2条下调表达（Cluster-4.34315；Cluster-4.43160）；这为绿原酸的生物合成研究奠定了基础，为利用基因工程提高种质的绿原酸含量提供了依据。

目录

声明

符号说明

1引言

1.1皱皮木瓜研究进展

1.1.1皱皮木瓜的生物学特性

1.1.2皱皮木瓜的药用价值

1.1.3皱皮木瓜药用成分的测定

1.1.4影响皱皮木瓜药用成分含量的因素

1.1.5绿原酸研究进展

1.2转录组测序技术功能与应用

1.2.1转录组技术概述

1.2.2转录组技术在药用植物中的应用

1.3研究目的与意义

2材料与方法

2.1试验地点

2.2试验材料及处理

2.2.1 药用成分测定材料

2.2.2遮荫和套袋处理试验材料

2.2.3 转录组试验材料

2.3皱皮木瓜药用成分及微量元素的测定

2.3.1仪器与试剂

2.3.2齐墩果酸、熊果酸的提取及含量测定

2.3.3绿原酸、原儿茶酸的提取及含量测定

2.3.4微量元素提取及含量测定

2.3.5数据处理与分析

2.4转录组测序方法

2.4.1样品总RNA提取

2.4.2文库构建与质检

2.4.3上机测序

2.4.4测序数据过滤

2.4.5组装

2.4.6数据分析

3结果与分析

3.1皱皮木瓜果实齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和原儿茶酸含量比较

3.2皱皮木瓜果实微量元素含量分析

3.3皱皮木瓜果实的微量元素与齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸相关性分析

3.4皱皮木瓜种质性状变异的主成分分析

3.5遮荫、套袋对皱皮木瓜药用成分的影响

3.5.1遮荫对皱皮木瓜药用成分的影响

3.5.2套袋对皱皮木瓜药用成分的影响

3.6转录组结果分析

3.6.1 RNA提取质量结果

3.6.2测序统计与质量分析

3.6.3 Unigene序列的功能注释

3.6.4 Unigenes的GO注释和分类

3.6.5 Unigenes的KOG功能注释和分类

3.6.6 Unigenes的KEGG代谢通路分析

3.6.7差异表达基因统计

3.6.8差异基因的GO富集分析

3.6.9差异基因KEGG富集分析

3.7绿原酸合成途径关键酶基因分析

4讨论

4.1不同种质皱皮木瓜药用成分含量差异原因

4.2皱皮木瓜果实药用成分和微量元素的相关性分析

4.3基于主成分分析的皱皮木瓜种质筛选

4.4遮荫套袋对皱皮木瓜药用成分的影响

4.5转录组数据分析

4.6皱皮木瓜绿原酸合成关键酶基因

5结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文