枸杞籽油对慢性应激小鼠抑郁样行为和认知障碍的改善作用与机制研究

摘要

目的：
　　本研究采用小鼠慢性不可预知应激模型（Chronic unpredictable stress,CUS）,研究枸杞籽油（Lycium barbarumseed oil,LBSO）对慢性应激引起的抑郁样行为（Depression-like behavior）和认知能力障碍（Cognitive deficits）的影响；并以中枢海马（Hippocampus）为研究对象，以期揭示LBSO的应激保护作用是否涉及抑制海马神经元的损伤及BDNF信号通路的调制。
　　方法：
　　采用小鼠慢性不可预知应激模型(Chronic unpredictablestress,CUS)。雄性ICR小鼠90只，适应性喂养3天后随机分为6组：正常组、模型组、阳性药物组(氟西汀,Fluoxetine,20mg/kg）、枸杞籽油低、中、高（2.5ml/kg，5ml/kg，10ml/kg）剂量组，每组15只，药物干预时间35天。除正常组群养于独立的实验室外，其余5组小鼠独笼饲养，并接受28天慢性不可预知刺激造模，这些刺激包括夹尾1min、4℃冰水游泳刺激5min、噪音刺激10min、禁食禁水24h、束缚1h、足底电击5min（30V，0.5Hz）、通宵照明、潮湿垫料。造模完成后所有小鼠依次接受旷场实验（Open field test,OFT）、悬尾实验（Tail suspension test,TST）、强迫游泳实验（Forced swim test,FST）、Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）四种行为学检验，共计7天。行为学检验完成后用4％水合氯醛麻醉小鼠，待角膜反射消失后眶丛取血，经离心后得血清用于Elisa法测定血清皮质酮含量。小鼠经取血后，分两种方式取材。每组10只小鼠取血后处死，开颅取海马，液氮速冻后转入超低温冰箱冻存。小鼠海马用于免疫印迹实验（Western Blot,WB），每组剩余小鼠心脏依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛，灌注完成后开颅取全脑，石蜡包埋后切片。脑切片用于组织形态学实验（包括HE染色和尼氏染色）和免疫组织化学实验（Immunohistochemistry,IM）。
　　结果：
　　1.枸杞籽油对慢性应激小鼠抑郁样行为的影响：
　　a.在旷场实验（OFT）中。与正常组相比，模型组小鼠穿越的格数降低（p<0.01）；与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠穿越的格数升高（p<0.01）。
　　b.在悬尾实验（TST）中。与正常组相比，模型组小鼠的不动时间升高（p<0.05）；与模型组相比，除枸杞籽油中剂量组无明显统计学差异外，各试验药物组小鼠的不动时间显著降低（p<0.01,p<0.05）。
　　c.在强迫游泳实验(FST)中。与正常组相比，模型组小鼠的不动时间显著升高（p<0.01）；与模型组相比，枸杞籽油低、中、高三个剂量组小鼠的不动时间均显著降低（p<0.01）。
　　以上实验结果表明：枸杞籽油可改善慢性应激小鼠的抑郁样行为。
　　2.枸杞籽油对慢性应激小鼠认知障碍的影响：
　　a.在Morris水迷宫（MWM）的空间记忆采集实验中。与正常组相比，模型组小鼠的逃逸潜伏期显著升高（p<0.05）；与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠的逃逸潜伏期显著降低（p<0.01）。与正常组相比，模型组小鼠的平均潜伏距离显著升高（p<0.05）；与模型组相比，除枸杞籽油中剂量组无明显统计学差异外，各试验药物组小鼠的平均潜伏距离显著降低（p<0.01,p<0.05）。空间记忆采集实验结果表明：枸杞籽油能缓解慢性应激小鼠的学习能力下降。
　　b.在Morris水迷宫（MWM）的空间探索实验中。与正常组相比，模型组小鼠的原平台象限游程比率显著降低（p<0.01）；与模型组相比，枸杞籽油高剂量组小鼠的原平台象限游程比率显著身高（p<0.05）。与正常组相比，模型组小鼠的原平台象限时间比率显著降低（p<0.01）。与模型组相比，各试验药物组与模型组的差异无统计学意义。与正常组相比，模型组小鼠的原平台有效穿越次数显著降低（p<0.01）；与模型组相比，枸杞籽油高剂量组小鼠的原平台有效穿越次数显著升高（p<0.01）。与正常组在第三象限极有目的性的探索轨迹相比，模型组小鼠在整个迷宫中的探索是无倾向性、无目的性的。与模型组无目的性的轨迹相比，除枸杞籽油中剂量组无明显差异外，各试验药物组小鼠的探索轨迹有较强的目的性。空间探索实验结果表明：枸杞籽油可能缓解慢性应激小鼠的记忆障碍。
　　3.枸杞籽油对慢性应激小鼠血清皮质酮的影响：
　　在Elisa测定小鼠血清皮质酮的实验中。与正常组相比，模型组小鼠的血清皮质酮显著升高（p<0.01）；与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠的血清皮质酮显著降低（p<0.01、p<0.05）。Elisa结果表明：枸杞籽油可以改善慢性应激小鼠的血清皮质酮含量升高。
　　4.组织形态学结果：
　　a.HE染色结果：相比于正常组，模型组小鼠CA1区锥体细胞数量显著低于正常组（p<0.05）与模型组相比，氟西汀和枸杞籽油低、高剂量组小鼠的CA1区锥体细胞数量均显著高于模型组（p<0.05，p<0.01）。表明枸杞籽油可改善慢性应激小鼠的神经元细胞丢失。
　　b.尼式染色结果：与正常组比较，模型组小鼠海马CA1区锥体细胞排列不规则，细胞间隙增大，细胞胞体内的尼氏小体减少或完全消失，细胞固缩。与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠的CA1区锥体细胞排列整齐紧凑，其胞体内部的尼氏小体清晰可见。表明枸杞籽油可改善慢性应激小鼠的神经元损伤。
　　5.免疫组织化学结果：
　　a.BDNF:与正常组相比，模型组小鼠BDNF在海马组织CA1、CA3和DG三个区的表达较弱，BDNF的平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著降低（p<0.01）。与模型组相比，各试验药物组DNF在海马组织CA1和DG两个区的表达显著增强，BDNF的平均光密度在CA1和DG两个区均显著升高（p<0.01）。氟西汀组（20mg/kg）和枸杞籽油高剂量组在海马组织CA1、CA3和DG三个区的表达均显著增强。BDNF的平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著升高（p<0.01）。
　　b.p-CREB:与正常组相比，模型组小鼠p-CREB在海马CA1、CA3和DG三个区的表达较弱。p-CREB的平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著降低（p<0.05、p<0.01），与模型组相比，除枸杞籽油中剂量组小鼠p-CREB只在海马CA1区表达显著增强；光密度显著升高（p<0.01）外。其余各实验组小鼠p-CREB海马CA1、CA3和DG三个区的表达均显著增强，平均光密度在CA1、CA3和DG三个区均显著升高（p<0.01）。
　　c.CREB磷酸化比率:与正常组相比，模型组小鼠CREB磷酸化比率在海马CA1、CA3和DG三个区均显著低于正常组。p-CREB/CREB在CA1、CA3和DG三个区均显著低于正常组（p<0.01、p<0.05）。与模型组相比，除枸杞籽油中剂量组小鼠CREB磷酸化比率只在海马CA1区显著上升；p-CREB/CREB显著升高（p<0.01）外。其余各实验组小鼠磷酸化比率在海马CA1、CA3和DG三个区均显著上升，p-CREB/CREB在CA1、CA3和DG三个区均显著升高（p<0.01）。
　　6.Western blot结果
　　a.BDNF：与正常组相比，模型组小鼠海马组织BDNF表达量显著降低（p<0.05）；与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织BDNF表达量显著升高（p<0.01）。
　　b.p-CREB：与正常组相比，模型组小鼠海马组织p-CREB表达量与正常组无明显统计学差异；与模型组相比，枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织p-CREB表达量显著升高（p<0.05）；氟西汀组无明显统计学差异。
　　c.CREB：与正常组相比，模型组小鼠海马组织CREB表达量与正常组无明显统计学差异；与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织CREB表达量均无明显统计学差异。
　　d.CREB磷酸化比率：与正常组相比，模型组小鼠海马组织中的CREB磷酸化比率显著降低（p<0.05）。与模型组相比，氟西汀组和枸杞籽油高剂量组小鼠海马组织中的CREB磷酸化比率显著升高（p<0.05）。
　　结论：
　　1.枸杞籽油具有改善慢性应激小鼠抑郁样行为和认知障碍的作用。
　　2.枸杞籽油的应激保护作用涉及海马神经元的损伤的保护和BDNF信号通路的调制。

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前言

材料与方法

1.材料

2.方法

结果

1. 行为学实验结果

2. 血清皮质酮Elisa法测定结果

3.组织形态学结果

4. 枸杞籽油对CUS小鼠海马组织中BDNF、CREB、p-CREB蛋白表达的免疫组化法检测结果

5.枸杞籽油对CUS小鼠海马组织中BDNF、CREB、p-CREB蛋白表达的Western blot法检测结果

讨论

结论

参考文献

文献综述:CREB与记忆

致谢

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