miRNA-20a靶向ATG16L1和ATG7抑制细胞自噬介导BCG的存活

摘要

目的：研究miR-20a对自噬基因ATG16L1和ATG7的靶向调控作用，及其通过调控细胞自噬介导结核分枝杆菌在巨噬细胞胞内存活的影响。
　　方法：1.利用雷帕霉素、3-MA和BCG处理RAW264.7细胞后，采用qRT-PCR检测miR-17-92簇中miR-20a等6种miRNAs的表达量；通过生物信息学软件分析miR-20a对自噬基因ATG16L1和ATG7靶向调控作用。
　　2.分别将ATG16L13’UTR和ATG73’UTR及其突变体克隆到pMIR-Report质粒中，通过双荧光素酶报告系统和Western blot，验证miR-20a对ATG16L1和ATG7的靶向调控作用。
　　3.将miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分别转染到RAW264.7细胞中，同时利用雷帕霉素与BCG刺激后，通过激光共聚焦显微镜、透射电镜、Western blot方法分别检测自噬小体分布及自噬相关蛋白表达水平，研究miR-20a对自噬过程的调控作用。
　　4.将miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分别转染到RAW264.7细胞中，同时用BCG和雷帕霉素处理细胞，利用qRT-PCR检测各组细胞中BCG的存活量。研究miR-20a对巨噬细胞内BCG存活量的调控作用。
　　结果：1.与对照组相比，雷帕霉素组RAW264.7细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表达水平显著上调（P<0.05）；3-MA组RAW264.7细胞的miR-20a表达水平显著下调（P<0.05）。与对照组相比，BCG感染细胞6h时，miR-20a的表达水平升高约8倍（P<0.01）。感染时间的延长至48h时，miR-20a的表达水平较之前有所下降，但仍高于对照组（P<0.05)。
　　2.生物信息学分析表明，ATG16L1和ATG7是miR-20a的靶基因。双荧光素酶报告系统结果显示，转染miR-20a mimic可明显抑制ATG16L1的相对荧光素酶活性，其活性下降约1.8倍(P＜0.05)；而转染ATG16L1-mut组相对荧光素酶活性没有明显变化。转染miR-20a mimic组ATG7的相对荧光素酶活性受到明显抑制，下降约1.6倍(P＜0.05)；而ATG7-mut组相对荧光素酶活性没有明显变化。
　　结果：表明，miR-20a可与ATG16L13′-UTR和ATG73′-UTR特异性结合抑制其表达。Western blot结果显示，miR-20a mimic能明显抑制ATG16L1和ATG7蛋白的表达，而miR-20a inhibitor组ATG16L1和ATG7蛋白表达量明显升高（P＜0.05），结果表明miR-20a可在转录后水平抑制ATG16L1和ATG7的表达。
　　3.细胞免疫荧光和透射电镜实验结果表明，转染miR-20a mimic组自噬小体标志蛋白LC3均匀分布于细胞质当中，自噬小体数量明显减少；相反，miR-20a inhibitor组细胞内的点状自噬小体明显增多。Western blot检测LC3的表达水平，结果显示，与对照组相比，miR-20a mimic组LC3-II表达量明显减少，LC3II/LC3I比值降低；miR-20a inhibitor组LC3II表达量明显升高,LC3II/LC3I比值升高；结果表明，miR-20a可以通过靶向抑制ATG16L1和ATG7的表达抑制BCG介导的细胞自噬过程。
　　4.在RAW264.7细胞中转染miR-20a mimic、inhibitor、靶基因siRNA，并向每组细胞中加入1×107/L的BCG共培养24h。实时荧光定量PCR检测BCG存活量，结果显示，miR-20a mimic组的BCG存活量显著高于正常组（P＜0.01），反之，转染miR-20a inhibitor后BCG存活量显著低于正常组（P＜0.01）。表明miR-20a可促进BCG在巨噬细胞中的存活。
　　结论：1.miRNA-20a可靶向抑制ATG16L1和ATG7蛋白的表达，抑制细胞的自噬水平，负向调控RAW264.7巨噬细胞的自噬。
　　2.miRNA-20a通过抑制RAW264.7巨噬细胞的自噬水平，上调BCG在巨噬细胞中的存活量。

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前言

第一部分 雷帕霉素、3-MA及BCG对RAW264.7细胞中miRNA表达的影响

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分 miR-20a靶基因的预测与验证

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分 miR-20a调控细胞自噬介导BCG感染

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述:MicroRNA对结核分枝杆菌感染宿主细胞的调控作用机制的研究

致谢

四、攻读硕士期间发表的学术论文

五、个人简历