枸杞多糖对兔视网膜色素上皮细胞光损伤凋亡内质网信号传导途径的影响

摘要

目的：
　　通过对体外培养的兔视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞进行不同时间的光照刺激，筛选出符合兔RPE细胞光损伤模型的最佳光照时间点。研究兔RPE细胞光损伤后参与细胞凋亡因子的表达情况，以及枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）干预防治后对细胞凋亡因子表达的影响。探讨LBP对兔RPE细胞光损伤的保护作用机制及其可能参与的信号传导途径，为临床应用LBP治疗年龄相关性黄斑变性以及视网膜光损伤类疾病等提供理论基础。
　　方法：
　　1.以体外培养的兔RPE细胞为研究对象，采用三基色LED冷光灯作为光源，光照强度(16500±200)Lux，进行不同时间（11h，16h，24h）的光照刺激，光照结束后立即进行MTT法检测不同光照刺激时间对兔RPE细胞活性的影响、流式细胞仪检测不同刺激时间对兔RPE细胞凋亡的影响。
　　2.制备高、中、低安全浓度的LBP培养基，预防性观察实验予光照前8h加入不同安全浓度的LBP培养基进行预处理，分别在光照处理结束后0h、6h、12h、24h进行各相应指标检测；治疗性观察实验予光照结束后立即加入高、中、低浓度的LBP培养基，放入培养箱中继续培养6h、12h、18h、24h进行相应指标检测。预防性和治疗性观察实验均设立五个分组，分别为：正常组、光损伤组、LBP低浓度组、LBP中浓度组、LBP高浓度组。
　　3.通过透射电镜观察兔RPE细胞光损伤后细胞微观结构的改变；流式细胞仪检测光损伤及LBP防治后兔RPE细胞内游离钙离子浓度的变化；蛋白免疫印迹（Western blot）法检测光损伤及LBP防治后兔RPE细胞内Caspase-12蛋白因子的表达情况。以探讨LBP对兔RPE细胞光损伤保护的分子作用机制及其可能参与的信号通路。
　　结果：
　　1.MTT法检测结果显示：与无光照组相比，兔RPE细胞在经过11h、16h、24h的光照刺激后，OD值均有所降低，差异有统计学意义（F=80.691，P=0.000）；且各光照组组间比较差异也均有统计学意义（P<0.05），表现为光照时间越长，兔RPE细胞损伤越重，OD值下降越明显。
　　2.Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测结果显示：兔RPE细胞经过11h、16h、24h的持续光照后，细胞损伤形式主要表现为凋亡，且随着光照刺激时间的延长，兔RPE细胞凋亡率逐渐增加。与无光照组比较，光照11h组细胞凋亡率升高，但差异无统计学意义（P>0.05），光照16h、24h组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。各光照组组间比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。
　　3.透射电镜结果显示：无光照组兔RPE细胞表面有许多微绒毛，细胞膜结构完整，胞浆内细胞器丰富，可见到线粒体、粗面内质网、核糖体等，核染色质分布均匀。而经过16h光照组的兔RPE细胞则出现了典型的细胞凋亡形态学改变：细胞体积缩小，表面微绒毛减少或消失，细胞膜结构完整无破损，胞浆内细胞器减少或消失，出现有大量的空泡，胞质浓缩，核染色质聚集成团，边聚、分散，或裂解成碎片。
　　4.流式细胞仪检测兔RPE细胞内游离Ca2+浓度的变化。
　　结果显示：
　　预防性观察结果显示：
　　①同时相内不同处理组之间比较：与正常组相比，各时相内光损伤组细胞内Ca2+荧光强度显著增高（P<0.01）。与光损伤组比较，0h、12h时相内LBP低、中、高浓度组细胞内Ca2+荧光强度明显降低，其中尤以LBP高浓度组降低最为显著（P<0.01），6h、24h时相内仅LBP高浓度组Ca2+荧光强度抑制明显（P<0.05）。LBP低、中、高浓度组之间两两比较：LBP低浓度组与LBP中浓度组：各时相内差异均无统计学意义（P>0.05）；LBP低浓度组与LBP高浓度组：0h、6h、12h时相内差异均有统计学意义（P<0.05），24h时相内差异无统计学意义（P>0.05）；LBP中浓度组与LBP高浓度组：仅6h、12h时相内差异有统计学意义（P<0.05）。
　　②同一处理组内不同时相之间比较：各处理组除6h与12h细胞内Ca2+荧光强度变化不明显，其他表现为：随时间延长，细胞内Ca2+荧光强度呈下降趋势，尤以LBP高浓度组24h结果
　　1.MTT法检测结果显示：与无光照组相比，兔RPE细胞在经过11h、16h、24h的光照刺激后，OD值均有所降低，差异有统计学意义（F=80.691，P=0.000）；且各光照组组间比较差异也均有统计学意义（P<0.05），表现为光照时间越长，兔RPE细胞损伤越重，OD值下降越明显。
　　2.Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测结果显示：兔RPE细胞经过11h、16h、24h的持续光照后，细胞损伤形式主要表现为凋亡，且随着光照刺激时间的延长，兔RPE细胞凋亡率逐渐增加。与无光照组比较，光照11h组细胞凋亡率升高，但差异无统计学意义（P>0.05），光照16h、24h组细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。各光照组组间比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。
　　3.透射电镜结果显示：无光照组兔RPE细胞表面有许多微绒毛，细胞膜结构完整，胞浆内细胞器丰富，可见到线粒体、粗面内质网、核糖体等，核染色质分布均匀。而经过16h光照组的兔RPE细胞则出现了典型的细胞凋亡形态学改变：细胞体积缩小，表面微绒毛减少或消失，细胞膜结构完整无破损，胞浆内细胞器减少或消失，出现有大量的空泡，胞质浓缩，核染色质聚集成团，边聚、分散，或裂解成碎片。
　　4.流式细胞仪检测兔RPE细胞内游离Ca2+浓度的变化。
　　结果显示：
　　（1）预防性观察结果显示：
　　①同时相内不同处理组之间比较：与正常组相比，各时相内光损伤组细胞内Ca2+荧光强度显著增高（P<0.01）。与光损伤组比较，0h、12h时相内LBP低、中、高浓度组细胞内Ca2+荧光强度明显降低，其中尤以LBP高浓度组降低最为显著（P<0.01），6h、24h时相内仅LBP高浓度组Ca2+荧光强度抑制明显（P<0.05）。LBP低、中、高浓度组之间两两比较：LBP低浓度组与LBP中浓度组：各时相内差异均无统计学意义（P>0.05）；LBP低浓度组与LBP高浓度组：0h、6h、12h时相内差异均有统计学意义（P<0.05），24h时相内差异无统计学意义（P>0.05）；LBP中浓度组与LBP高浓度组：仅6h、12h时相内差异有统计学意义（P<0.05）。
　　②同一处理组内不同时相之间比较：各处理组除6h与12h细胞内Ca2+荧光强度变化不明显，其他表现为：随时间延长，细胞内Ca2+荧光强度呈下降趋势，尤以LBP高浓度组24h降低最为明显（P<0.05）。
　　（2）治疗性观察结果显示：
　　①同时相内不同处理组之间比较：与正常组相比，各时相内光损伤组细胞内Ca2+荧光强度显著增强（P<0.01）。与光损伤组比较，12h、18h、24h时相内 LBP低、中、高浓度组细胞内Ca2+荧光强度明显降低，尤以LBP高浓度组降低最为显著（P<0.01），6h时相内仅LBP中、高浓度组细胞内Ca2+荧光强度抑制明显（P<0.05）。LBP低、中、高浓度组之间两两比较：LBP低浓度组与LBP中浓度组：6h时相内差异无统计学意义（P>0.05），12h、18h、24h时相内差异均有统计学意义（P<0.05）；LBP低浓度组与LBP高浓度组：各时相内差异均有统计学意义（P<0.05）；LBP中浓度组与LBP高浓度组：仅6h时相内有统计学意义（P<0.05）。
　　②同一处理组内不同时相之间比较：光损伤组、LBP低浓度组、LBP高浓度组：随着时间延长，细胞内Ca2+荧光强度呈下降趋势，其中18h与24h差异无统计学意义（P>0.05）；LBP中浓度组：与6h比较，12h、18h、24h细胞内Ca2+荧光强度均明显减弱，差异有统计学意义（P<0.05），但12h、18h、24h组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
　　5.Western-blot法检测Caspase-12蛋白的表达。
　　结果显示：
　　（1）预防性观察结果显示：
　　①同时相内不同处理组之间比较：与正常组相比，各时相内光损伤组Caspase-12蛋白的表达显著增加（P<0.01）；与光损伤组比较，各时相内LBP中、高浓度组Caspase-12蛋白的表达明显受到抑制，尤以LBP高浓度组抑制最为显著（P<0.01），12h、24h时相内LBP低浓度组即有效抑制了Caspase-12蛋白的表达（P<0.05）；LBP低、中、高浓度组之间两两比较：LBP低浓度组与LBP中浓度组：6h时相内差异有统计学意义（P<0.05），0h、12h、24h时相内差异均无统计学意义（P>0.05）；LBP低浓度组与LBP高浓度组：各时相内差异均有统计学意义（P<0.05）；LBP中浓度组与LBP高浓度组：仅12h、24h时相内差异有统计学意义（P<0.05）。
　　②同一处理组内不同时相之间比较：各处理组均表现为随着时间延长，兔RPE细胞内 Caspase-12蛋白的表达呈下降趋势，尤以 LBP高浓度组24h下降最为明显（P<0.05）。
　　（2）治疗性观察结果显示：
　　①同时相内不同处理组之间比较：与正常组相比，各时相内光损伤组细胞内Caspase-12蛋白的表达均显著上调（P<0.01）；与光损伤组比较，6h、18h、24h时相内LBP低、中、高浓度组细胞内Caspase-12蛋白的表达明显受抑，尤以LBP高浓度组抑制最为显著（P<0.01），12h时相内仅LBP中、高浓度组抑制明显（P<0.05）；LBP低、中、高浓度组之间两两比较：LBP低浓度组与LBP中浓度组：12h时相内有统计学意义（P<0.05），6h、18h、24h时相内均无显著性差异（P>0.05）；LBP低浓度组与LBP高浓度组比较，各时相内差异均具有统计学意义（P<0.05）；LBP中浓度组与LBP高浓度组：18h、24h时相内差异有统计学意义（P<0.05），6h、12h时相内差异无统计学意义（P>0.05）。
　　②同一处理组不同时相之间比较：除光损伤组18h与24h、LBP低浓度组6h与12h差异无统计学意义（P>0.05），其他均表现为随时间延长，细胞内Caspase-12蛋白的表达呈下降趋势，尤以LBP高浓度组24h降低最为明显（P<0.05）。
　　结论
　　1.光照强度（16500±200）lux，光照时间11h、16h、24h对体外培养的兔RPE细胞具有不同程度的细胞损伤及凋亡作用。
　　2.光照强度（16500±200）lux，光照时间16h为本实验所筛选的最佳光损伤模型的构建条件。
　　3.体外培养的兔RPE细胞经过光照刺激后细胞微观结构发生了变化。
　　4.光损伤促进了细胞内游离Ca2+浓度的升高及Caspase-12蛋白因子的表达。
　　5.枸杞多糖通过抑制兔RPE细胞内游离Ca2+浓度及Caspase-12蛋白因子的表达，达到保护兔RPE细胞的目的。
　　6.枸杞多糖对兔RPE细胞光损伤凋亡的这一保护作用可能是通过抑制内质网信号通路来实现的。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

第一部分 可见光照射对体外培养兔视网膜色素上皮细胞凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 枸杞多糖对兔视网膜色素上皮细胞光损伤凋亡内质网信号途径的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:枸杞多糖提取工艺优化及药理作用研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

个人简历