PFOS暴露对新生鼠海马的损伤及外源性神经干细胞移植的干预作用

摘要

全氟辛烷磺酸(Perfluorooetane sulfonate,PFOS)是广泛存在的，化学性质非常稳定的环境污染物。PFOS被发现存在潜在的神经毒性，尤其对于处在生长发育期的动物更为敏感。海马是大脑参与学习、记忆过程中的重要结构，海马齿状回的神经干细胞是成年后能增殖、分化成神经元的部位之一，其极易受外界环境因素的影响，导致神经发生不足。近年来，对于PFOS引起的神经毒性作用受到关注，但其损伤机制尚不清楚,更无有效的手段来修复其对中枢神经系统的损伤。外源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植作为一种治疗手段，能代替、修复中枢损伤的神经元，为脑损伤修复带来了希望。
　　目的：探讨PFOS暴露对新生鼠海马结构和认知功能影响及可能的损害机制，同时探讨外源性NSCs移植可能的干预作用。
　　方法：实验一：将实验动物随机分为对照组和模型组，每组各35只。模型组给予PFOS10mg/kg·d腹腔注射染毒，对照组给予等量含2％Tween-80的生理盐水，共4周。记录体重，并行水迷宫、旷场实验、滚轮实验以观察神经行为变化，确定造模成功。取海马组织行HE染色，观察形态结构改变。实验二：取新生一天SD幼鼠第三脑室室管膜区组织完成神经干细胞培养及鉴定，经枕大池行蛛网膜下腔神经干细胞移植，将实验动物分为：对照组（Con）、单纯移植组(T)、移植干预组(P10+T)和模型组(P10)，分别在移植后1、2、4周记录体重，同时行水迷宫、旷场实验等观察神经行为变化，并在移植后第4周，取材采用HE染色观察NSCs移植对海马组织形态的影响；采用Western blot和qRT-PCR技术检测海马α7nAChR蛋白和mRNA的表达水平；采用ELISA法观察血清IL-1β；采用高效液相法测定海马组织氨基酸水平。实验三：将实验动物分为对照组(Con，等量生理盐水)，低剂量染毒组（P5，5mg/kg·d PFOS组），高剂量染毒组（P10，10mg/kg·d PFOS组），每组10只，染毒4周。4周后，采用Dot-blot技术，检测炎性因子CINC-3、CNTF、IL-1β、IL-6、TNF-α的变化；采用Western-blot和qRT-PCR检测海马组织表观遗传修饰相关调控酶Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白和mRNA表达水平。
　　结果：实验一：1.PFOS暴露对一般情况的影响，模型组出现肛门周围粪便沾染严重，活动减缓、少动呆卧、嗜睡、进食量减少及消瘦等神经抑制症状，同时，模型组与对照组比较，幼鼠体重增长减缓（P<0.05）；2.PFOS暴露对神经行为的影响，结果显示：水迷宫实验学习的第2天，模型组的逃逸潜伏期即长于对照组（P<0.05），并随暴露时间显著性差异更加明显（P<0.01），在第5天撤去平台测试时，模型组目标象限停留时间和跨台次数均少于对照组（P<0.05、P<0.01）；旷场实验中，与对照组比较，模型组的中央格停留时间长（P<0.01）、站立次数少（P<0.01）、总距离短（P<0.01）；滚轮实验中，模型组在转杆上持续的时间与对照组比较无显著性差异（P>0.05）；3.PFOS暴露对海马组织形态的影响，模型组海马神经元排列紊乱、轮廓模糊、核固缩，并且海马CA1区和齿状回闩区神经细胞数量也明显少于对照组。实验二：1.外源性NSCs移植对一般情况的影响，结果显示：与P10组比较，P10+T组在移植后4周时精神逐渐好转、活动增加，但体重仍无显著性差异（P﹥0.05）；2.外源性NSCs移植对神经行为学的影响，结果显示：移植后4周，与P10组比较，P10+T组目标象限停留时间延长（P﹤0.05）、中央格停留时间明显缩短（P﹤0.01）、站立次数增多（P﹤0.05），行走总距离增长（P﹤0.05）；3.外源性NSCs移植对海马组织形态的影响，结果显示：P10+T组与P10组比较，神经元排列趋于整齐、密度增高、细胞形态有所恢复；4.外源NSCs移植对大鼠海马炎性因子IL-1的影响，与Con组比较，P10组血清中IL-1β明显升高(P﹤0.001)；P10+T组的IL-1β水平与P10组比较显著下降(P﹤0.001)；5.外源性NSCs移植对海马α7nAChR的影响，结果显示：与Con组比较，P10组α7nAChR蛋白和mRNA表达水平明显降低(均为P<0.001)；与P10组比较，P10+T组海马区α7nAChR蛋白和mRNA表达水平均明显升高(均为P<0.001)；6.外源性NSCs移植对海马组织氨基酸水平的影响，结果显示：与Con组比较，P10组谷氨酸含量明显降低（P﹤0.05）；而与P10组比较，P10+T组谷氨酸含量明显升高（P﹤0.05）。实验三：1.PFOS早期暴露对海马组织炎性因子的影响，与Con组比较，P5组和P10组的CINC-3、CNTF、IL-1b、IL-6、TNF-a等炎性因子水平均明显升高。与P5组比较，P10组海马CINC-3、CNTF、TNF-a的表达水平均明显升高（P<0.05）；2.PFOS早期暴露对海马组织表观遗传修饰相关调控酶的影响，Western blot检测Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表达水平，结果显示，与Con组比较，P5和P10组Dmnt3a均明显增高（P<0.01），而EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表达水平，P5组明显降低（P<0.05、P<0.001、P<0.001），P10组也明显降低（P<0.01、P<0.001、P<0.001）。同时，与P5组比较，P10组Dmnt3a明显增高（P<0.05），而EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。采用qRT-PCR进一步观察Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8mRNA水平的变化，与Con组比较，P5组Dmnt3a mRNA表达水平无明显差异（P﹥0.05），而EpC1、Suv420h2、Hdac8mRNA表达水平明显降低（P<0.01、P<0.001、P<0.001）。同时，P10组Dmnt3a mRNA表达水平显著增高（P<0.001），而EpC1、Suv420h2、Hdac8mRNA表达水平均降低(均为P<0.001)。但P10组与P5组比较，以上mRNA表达均无明显差异（P﹥0.05）。
　　结论：1.PFOS早期暴露可损害海马组织结构和引起空间学习记功能障碍；2.PFOS暴露的神经毒性机制可能与海马区出现表观遗传修饰异常和免疫炎性反应有关；3.外源性NSCs移植可以促进海马胆碱能神经元表达、抑制神经免疫炎性反应，进而抑制PFOS对海马的神经毒性作用，改善记忆功能。

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前言

实验一 PFOS暴露对新生鼠神经行为、海马组织的影响

实验材料与方法

实验结果

实验二 外源性NSCs移植对PFOS神经毒性的干预作用

实验材料与方法

实验结果

实验三 新生期PFOS胁迫的神经毒性作用机制的实验研究

实验材料和方法

实验结果

讨论

1、神经发育早期对PFOS暴露敏感，且毒性有延后效应

2、神经发育早期PFOS暴露，对表观遗传修饰影响较大

3、PFOS早期暴露导致成年海马神经发育不足,?7nAChR 受体表达减少

4、神经发育期PFOS暴露，引起神经免疫炎症

5、外源性神经干细胞移植可干预PFOS暴露引起的神经损害

结论

参考文献

综述:PFOS的神经毒性

致谢

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