小鼠海马神经元细胞系中Purα基因敲除后对DNA损伤的修复作用的影响

摘要

目的人神经系统中尤为重要的转录因子Purα，是体内一个重要的转录因子，不只在神经系统，在体内的许多环节中都有很重要的作用，它与神经元的发育，突触形成都有很密切的关系。本文通过建立Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。方法 1）CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建以及鉴定：依据目的基因靶向去除外显子的位置来设计相对应的sgRNA序列，合成相应的寡核苷酸后克隆在pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)V2.0质粒载体相对应的位点上，挑选阳性克隆进行酶切和测序鉴定；2）稳定细胞系的建立及鉴定：将克隆好的CRISPR/Cas9-Purα质粒转染到小鼠海马神经元（HT22）细胞中，加入嘌呤霉素进行抗性筛选，保留正常生长的细胞进行培养，运用RT-PCR和Western blot技术分别检测mRNA和蛋白质的表达水平以了解Purα基因的表达情况；3）Purα在DNA损伤修复中的作用：分别用羟基脲（HU）处理细胞，通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。结果 测序的结果证实所插入片段相位正确；利用TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性，可以导致基因组碱基发生突变，RT-PCR和Western blot实验结果证实了敲除组的Purα基因表达明显降低。HU致损后，Purα敲除组的细胞DNA损伤更加明显。结论 利用CRISPR/Cas9 技术将Purα基因敲除后，用嘌呤霉素抗性进行筛选而建立稳定表达的Purα基因敲除的小鼠海马神经元的细胞系，Purα基因敲除后，细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感。该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。

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第一部分：应用CRISPR/Cas9技术构建Purα基因敲除质粒及细胞系

前 言

材 料

方 法

实验结果

1. CRISPR/Cas9-Purα基因敲除质粒构建和鉴定

讨 论

参考文献 (References)

第二部分：Purα在DNA损伤与修复中的作用研究

前 言

方 法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献 (References)

致 谢

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