锌指蛋白146对大鼠放射性脊髓损伤的影响及机制研究

摘要

放射性脊髓损伤（radiation spinal cord injury，RSCI）是肿瘤放疗中不可逆的严重并发症。近年来，随着放疗在肿瘤综合治疗中的广泛应用，RSCI的患病人数显著上升[1]。尤其是颈胸部肿瘤放疗极易引起严重并发症，后期往往发展为完全瘫痪[1]。由于其发病机制不清，目前尚无有效的治疗方法。目前认为高血压、糖尿病、脊柱畸形、血管疾病和疟疾病史等均是该病的高危因素，许多化疗药物的神经毒性也会导致放疗后的脊髓损伤[1]。因此，阐明电离辐射诱导大鼠脊髓神经元损伤的分子机制，有利于明确脊髓辐射损伤的发病机理。 正常人脊髓耐受辐射剂量不超过 50 Gy，而大于 60 Gy的辐射剂量容易引起脊髓辐射性损伤[2]。研究发现，正常人颈髓的辐射耐受剂量约为 70 Gy[3]。RSCI 患者损伤脊髓常出现脱髓鞘、白质区坏死及大量炎细胞浸润等病理改变[4][5]。脊髓损伤早期，神经细胞水肿常引起头痛、头晕等急性反应[6][7]。然后，巨噬细胞大量活化释放 IL-1和 TNF-α，吞噬坏死的组织细胞；最后，神经元变性凋亡，存活神经元数量减少，损伤部位出血坏死，神经胶质疤痕形成[1][4]。大剂量电离辐射引起脊髓组织神经元、胶质细胞、细胞外基质的综合损伤最终导致神经元数量下降和功能异常，临床表现为机体运动和感觉功能障碍[8][9]。因此，在 RSCI中，脊髓神经元是损伤的主要靶细胞[10]。探索辐射后脊髓神经元的损伤原因及机制对放射性脊髓损伤防治具有重要意义。 前期研究中我们发现了一种高表达于大鼠中枢神经系统的DNA损伤修复蛋白—RNF146[11]。Rnf146是新近发现的一种内源性神经保护基因，其编码产物为具有E3泛素连接酶活性的锌指蛋白146（Ringfinger protein 146，RNF146），也称为Iduna[12]。大剂量电离辐射等外部刺激造成细胞DNA损伤时，机体会迅速启动DNA损伤修复机制以保持基因组的完整性[13]。RNF146作为一种DNA损伤反应蛋白，序列高度保守[11]。RNF146特异性识别PARsylation-AIF，诱导其泛素化降解，控制AIF入核，抑制Parthanatos，从而对神经系统产生保护作用[14][15]。由于RNF146的泛素连接酶活性依赖于细胞内聚腺苷酸二磷酸核糖[poly （ADP-ribose），PAR]的浓度[16]，所以RNF146作用的对象通常是一些发生PAR化修饰的蛋白。 我们对文献中提到的发生PA R化修饰且与细胞增殖、凋亡和自噬相关的蛋白分子，如轴蛋白（Axin） [17]、MIKI[18]、BRCA1[19]、SH3BP2[20]和PTEN[21]等进行了逐一检测。我们发现抑癌基因PTEN在辐射后的脊髓组织中表达上调。PTEN是具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性的双重磷酸酶，通过催化三磷酸肌醇（PI3P）脱磷酸为二磷酸肌醇（PI2P）而拮抗磷脂酰肌醇-3磷酸激酶（PI3K），抑制Akt活性，引起细胞周期停滞，诱导凋亡、抑制粘附和迁移[22]。PTEN上调是导致RSCI大鼠脊髓前角运动神经元凋亡的原因吗？PTEN的上调与RNF146下调有关吗？脊髓前角运动神经元中泛素连接酶RNF146对PTEN有调控作用吗？其分子机制是什么？ 针对以上问题，本研究拟以RNF146调控PTEN为突破口，从动物水平和细胞水平，探索RSCI病理进程中RNF146对PTEN的调控在运动神经元凋亡中扮演的角色，为后期RSCI临床防治提供新的靶点和思路。 第一部分 X射线辐射对大鼠脊髓损伤及 RNF146和 PTEN表达的影响 目的观察大剂量X射线辐射对正常大鼠脊髓组织形态和前角运动神经元存活以及RNF146、PTEN蛋白表达的影响。 方法取成年雄性SD大鼠60只，随机分为3组，每组20只，给予40Gy X射线辐照，实验分组为空白对照组、辐射后24 h组、辐射后48 h组。通过对3张连续脊髓石蜡切片进行HE染色、Nissl染色及NeuN免疫组化染色，观察X射线辐射后24 h、48 h大鼠脊髓组织病理学改变以及前角神经元存活数量变化；TUNEL染色评价X射线辐射后24 h及48 h大鼠脊髓前角神经元的凋亡情况；免疫组化、荧光染色分别检测RNF146、PTEN在脊髓运动神经元中的定位及表达情况；Western blot分析评价X射线辐射对大鼠脊髓中RNF146及PTEN蛋白表达的影响。 结果 HE染色结果显示，X射线辐射后24 h，脊髓前角运动神经元发生明显细胞皱缩，同时胶质细胞数量较对照组明显减少；辐射后48 h，可见运动神经元细胞深染、固缩，甚至出现细胞空泡现象。Nissl染色显示辐射后24 h，神经元出现皱缩，细胞质深染；48 h后，神经元损伤更严重，出现细胞空泡；同时辐射后胶质细胞数量明显少于对照组，结果与HE染色结果一致。TUNEL染色提示辐射后，无论24 h还是48 h，神经元均发生了明显的DNA损伤，出现了细胞的凋亡。免疫组化及荧光染色表明RNF146定位于大鼠脊髓运动神经元的细胞质，且辐射后，24 h和48 h组RNF146表达量明显减少；而辐射后PTEN的表达量明显增加，且PTEN定位于神经元细胞质。Western blot实验结果证实，辐射后，RNF146蛋白表达量明显减少，而PTEN蛋白的表达量明显增加；这一结果与免疫组化结果是一致的。 结论 大鼠在接受40 Gy剂量的X射线全身辐射后，脊髓前角运动神经元出现严重的损伤，神经元发生明显的凋亡；辐射后，RNF146的表达水平显著降 低，而同时PTEN的表达量明显增加。 第二部分 辐射模拟剂新制癌菌素诱导 HT22细胞发生损伤及其分子机制 目的本实验以HT22细胞为细胞模型，研究X射线辐射所引起的神经元细胞的凋亡及RNF146调控PTEN表达的分子机制；为避免细胞辐射模型构建过程中不确定因素，本研究以辐射模拟剂新制癌菌素NCS模拟X射线辐射。 方法 消化生长状态良好的HT22，接种至培养板中，分别给予0、300、600、1000、2000、3000 ng/ml浓度的NCS，通过CCK8细胞活性实验检测NCS对HT22细胞增殖速率的影响，初步确定构建细胞辐射损伤模型的最佳剂量；该剂量处理HT22细胞，Hoechst与TUNEL染色分别检测HT22细胞染色质凝集现象和细胞凋亡情况；Western blot检测细胞中RNF146、PTEN蛋白的表达变化；通过慢病毒过表达HT22细胞中的RNF146；实验分为空白对照组（Con）、Vehicle组、LV-RNF146组；空白对照组、Vehicle组与LV-RNF146组分别给予NCS模拟剂处理48 h，检测HT22细胞中PTEN蛋白的表达变化；进一步通过CO-IP以及泛素化检测分析RNF146对PTEN蛋白的调控机制。 结果 细胞活性实验初步确定1000 ng/ml的NCS为构建HT22细胞辐射损伤模型的最适浓度；该剂量NCS处理细胞后，Hoechst与TUNEL染色显示细胞出现了明显的DNA断裂，揭示细胞发生明显的凋亡；同时，Western blot结果表明HT22细胞中RNF146蛋白表达水平明显降低，而PTEN蛋白表达水平显著升高；慢病毒上调HT22细胞中RNF146后，PTEN蛋白表达量明显低于对照组，揭示在NCS模拟X射线辐射HT22细胞过程中，RNF146可以调控PTEN蛋白的表达。进一步CO-IP和泛素化检测证实RNF146可以通过调控PTEN蛋白的泛素化影响细胞辐射损伤进程。 结论 NCS 模拟 X 射线辐射能够诱导 HT22 细胞发生凋亡，该过程中RNF146通过调控 PTEN蛋白泛素化发挥着重要作用。

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