补青颗粒对H2O2诱导的大鼠晶状体抗氧化应激的作用及机制研究

摘要

目的: 在 H2O2诱导晶状体的氧化应激模型中，观察不同浓度的补青颗粒对离体培养的大鼠晶状体是否具有保护作用及对蛋白 TTase（硫醇转移酶）和 Trx（硫氧还蛋白）的影响，为补青颗粒临床防治年龄相关性白内障（age-elated cataract，ARC）提供临床依据。 方法: 1）含药血清制备：SPF级8周龄雄性SD大鼠40只，随机分为5组：空白血清组（1mL/100g生理盐水）、阳性对照组（1g?mL-1 杞菊地黄丸水溶液）、补青颗粒高、中、低浓度组（分别为4g?mL-1、2g?mL-1、1g?mL-1补青颗粒水溶液），每组8只，每日2次灌胃给药，连续给药4天，取血，离心，取上清液即为含药血清。 2）健康SD大鼠60只，120只眼，雄性。采用7％水合氯醛（0.6mL/100g）腹腔麻醉后颈椎脱臼处死大鼠，取其晶状体，置于 37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱离体培养8h后，弃去混浊的晶状体。将剩余的晶状体随机分成6组，每组16只，分别为：空白对照组、模型组、杞菊地黄丸组、补青颗粒高浓度组、补青颗粒中浓度组、补青颗粒低浓度组。 3）观察各组晶状体混浊情况。选用 HE 染色法观察各组晶状体的病理改变情况。测定各组晶状体蛋白热稳定性情况。用ELISA法测各组晶状体中TTase和Trx含量。取各组晶状体，采用实时定量聚合酶扩增反应（Real Time-PCR法）检测晶状体中TTase和Trx在RNA水平的表达；免疫蛋白印迹法（Western Blot法）测定晶状体中TTase和Trx的蛋白表达水平。 结果: 1）晶状体混浊程度：空白组晶状体在整个孵育过程中基本保持透明状态，可完整 透过“+”字线。其他各组晶状体随孵育时间的延长，晶状体开始出现不同程度的皮质混浊。其中模型组“+”字线条完全不见，晶状体完全混浊。其余各含药血清组晶状体均较模型组清晰，补青高浓度组晶状体较清晰，能比较完整的透过“+”字线； 2）HE染色：空白组细胞形态整齐规则，纤维排列紧密。模型组晶状体上皮细胞形态不规则，染色深浅不一，排列紊乱，胞质破裂且有较多空泡形成。其余各含药血清组均较模型组晶状体组织损伤减轻。其中补青颗粒高浓度组晶状体上皮细胞排列较整齐，胞质较完整。 3）蛋白热稳定性：空白组的OD值始终趋于平稳，其余各组的OD 值均升高。除空白组外，各组在50℃~56℃区间OD值上升缓慢，趋势较平稳，组间比较无显著性差异；在62℃~86℃区间OD值上升迅速，趋势较陡峭，晶状体蛋白混合上清液混浊明显且混浊速度较快，模型组与空白组比较，差异显著（P＜0.01）；各给药组与模型组比较，OD值上升较平稳，差异显著（P＜0.05或0.01）。 4）ELISA检测与空白组比较，TTase、Trx模型组活性较空白组明显降低，具有显著统计学差异（P＜0.01）；与模型组比较，补青颗粒高浓度组活性明显升高，具有显著统计学差异（P＜0.01）；补青颗粒中浓度组、补青颗粒低浓度组与模型组比较，其活性升高，具有统计学差异（P＜0.05）。 5）Western blot：检测结果表明，TTase：与空白组大鼠比较，模型组大鼠晶状体表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，给予补青颗粒含药血清干预后，蛋白表达水平升高（P＜0.01）。Trx：与空白组大鼠比较，模型组大鼠晶状体表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，给予补青颗粒含药血清干预后，表达水平升高（P＜0.01）。 6）Real-Time PCR：实时荧光定量PCR结果显示，与空白组大鼠比较，模型组大鼠晶状体中TTase mRNA水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，给予补青颗粒含药血清干预后，各组大鼠TTase mRNA水平显著上升（P＜0.01）。与空白组大鼠比较，模型组大鼠晶状体中Trx mRNA水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，给予补青颗粒含药血清干预后，各组大鼠中Trx mRNA水平显著上升（P＜0.01）。 结论: 1. 氧化应激损伤可能是H2O2诱导的大鼠晶状体混浊的主要机制之一。 2. 补青颗粒能够延缓氧化应激所导致的大鼠晶状体的混浊，并且对组织结构有较好的保护作用。 3. 补青颗粒可能通过上调晶状体中 TTase（硫醇转移酶）与 Trx（硫氧还蛋白）的表达，对H2O2所致离体培养的大鼠晶状体混浊的发生和发展起到防止、延缓的目的。 4. 补青颗粒高浓度 4g?mL-1和中浓度 2g?mL-1干预氧化应激所造成的大鼠晶状体混浊的效果较好。

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