棉花茎尖遗传转化体系的建立和转betA/als、gna基因植株的产生

摘要

棉花基因工程的发展大大促进了抗虫、抗除草剂、抗病、抗逆和高品质纤维等棉花品种的培育.但是离体培养再生植株困难、基因型依赖性强、转化周期长、效率低等严重制约棉花基因工程育种的发展.因此,建立一套高效、快速、不受基因型限制的棉花遗传转化体系是加快棉花基因工程发展的关键.该论文以三个优良棉花栽培品种(鲁原890、鲁原1138、8626)的黄化小苗裸露茎尖为受体,通过农杆菌介导法进行转化,获得了转基因植株.该体系将棉花种子进行表面消毒,暗培养获得黄化小苗.黄化小苗长至7~10cm时,剥掉种皮和一片子叶,裸露出小苗茎尖,用解剖针轻轻划伤茎尖分生组织后,将蘸有农杆菌菌液的棉球放到小苗顶端,持续一定时间后取下棉球,用无菌滤纸吸去感染部位的残留菌液.浸染小苗共培养3天后,移栽到蛭石中.待小苗处于2-3叶期时,用除草剂筛选.然后对除草剂抗性植株进行PCR检测,确定转基因植株.该工作对影响转化效率的因素进行了梯度实验,建立了高效的遗传转化体系.结果表明,以鲁原890和鲁原1138为材料,最佳转化菌液浓度和浸染时间分别为OD<,600>0.8和10min;而8626的最佳菌液浓度和浸染时间为OD<,600>1.0和15min.同时,该工作以鲁原890为材料研究了真空渗透和表面活性剂处理对转化效率的影响.结果表明,适当的真空渗透和表面活性剂Silwet-L77处理能显著提高转化效率.在0.5×10<'5>Pa下,鲁原890最高达到了13﹪左右的转化率,而经0.02﹪的Silwet-L77处理,转化率也达到了10﹪,均高于已报道的棉花遗传转化频率.由于该转化体系以裸露的茎尖为转化受体,不需要组织培养和植株再生过程,因此基因型依赖性小,转化周期短,仅需45-50天即可获得转基因植株.而且,转化频率高,最高可达13﹪.这为棉花基因工程的发展打下了良好的基础.为了获得抗虫、耐盐、抗除草剂的转基因棉花品种,该工作分别将雪花莲凝集素(GNA)基因gna、胆碱脱氢酶(CDH)基因betA和乙酰乳酸合成酶基因als导入三个棉花品种,获得了转gna基因植株和转betA/als基因植株.转gna基因植株后代的抗蚜性统计表明,部分株系的抗蚜性明显提高.部分转betA/als基因植株的种子在用0.6﹪的NaCl溶液连续浇灌1 5天后,萌发率从13.3﹪到40﹪不等,均明显高于未转基因对照的萌发率(3.3﹪),说明转基因植株子代的耐盐性得到提高.这为棉花抗虫、耐盐、耐除草剂育种创造了优异材料.

目录

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摘要

ABSTRACT

符号说明

1前言

1.1棉花遗传转化的受体系统

1.2棉花遗传转化的方法

1.2.1农杆菌介导法

1.2.2基因枪轰击法

1.2.3花粉管通道法

1.2.4棉花转化的其他方法

1.3棉花抗虫基因工程研究进展

1.4棉花耐盐性研究和耐盐育种

1.4.1棉花耐盐性研究

1.4.2棉花耐盐育种现状

1.4.3甜菜碱相关基因工程研究

1.5棉花抗除草剂基因工程及als突变基因的应用

1.6本工作的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1棉花品种

2.1.2农杆菌菌株和质粒

2.1.3培养基

2.1.4药品、试剂和溶液

2.2方法

2.2.1棉花无菌黄化苗的产生

2.2.2农杆菌培养

2.2.3茎尖转化和共培养

2.2.4转化植株的筛选与定植

2.2.5 CTAB法微量提取棉花叶片DNA

2.2.6转化植株的PCR检测

2.2.7转化植株PCR-Southern杂交检测

2.2.8转基因植株子代的抗性测定

3结果与分析

3.1转化植株的产生和检测

3.1.1转化植株的产生

3.1.2除草剂筛选浓度的确定和抗性植株筛选

3.1.3转化植株的PCR和PCR-Southern杂交检测

3.2农杆菌LBA4404转化条件的优化

3.2.1菌液浓度对转化率的影响

3.2.2浸染时间对转化率的影响

3.2.3真空渗透对转化率的影响

3.2.4表面活性剂对转化率的影响

3.3转gna棉花T1代植株的PCR检测及抗蚜性统计

3.3.1转gna棉花T1代植株的PCR检测

3.3.2转gna棉花T1代植株的抗蚜性观测

3.4转betA棉花T1代种子萌发期的耐盐性检测

4讨论

4.1农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化体系的建立

4.1.1棉花转基因受体系统的比较

4.1.2提高转化率的措施

4.2转gna棉花的利用价值

4.3转betA棉花的耐盐性

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文