脐血CD34及CD133细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的初步研究

摘要

目的：以新生wistar大鼠为实验对象，建立原代肝细胞培养方法并优化培养条件。观察大鼠肝细胞培养上清对异种肝细胞的代谢及增殖刺激作用。采集脐血并分离脐血单个核细胞(MNC)。分离提纯脐血来源CD34<'+>及CDl33<'+>细胞。流式细胞仪分析磁性分选效率。初步探讨脐血来源的CD34<'+>及CDl33<'+>细胞在体外培养条件。观察CD34<'+>及CDl33<'+>在特定条件下是否可转分化为肝细胞样细胞。 方法： 1.使用组织块培养法和消化分离法进行肝细胞的体外培养。通过观察细胞生长增殖情况、PAS染色、MTT法检测细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性来判断培养基对细胞生长的支持作用，改善细胞培养条件。 2.收集大鼠乳鼠对数生长期原代肝细胞培养上清，观察其对异种肝细胞的增殖及代谢刺激作用。 3.使用采血袋或自制防凝采血瓶，利用负压抽吸原理采集健康剖宫产新生儿脐静脉血。使用国产淋巴细胞分离液或Ficoll-paque plus，利用密度梯度离心原理分离脐血MNC。计算每毫升脐血回收MNC数量。 4.利用MiniMACS系统，富集脐血CD34<'+>及CDl33<'+>细胞。 5.采用直接免疫荧光标记法，使用流式细胞仪测定脐血中MNC及分选后细胞的CD34和CDl33的表型分布特点。 6.通过观察培养细胞形态及生长曲线判断细胞生存状况。改变接种细胞密度、和培养基胎牛血清的含量来探讨CD34<'+>及CDl33<'+>细胞适宜的培养环境。 7.在体外特定的培养条件下，进行诱导分化为具有一定肝细胞特性的细胞的实验研究。观察记录各组阳性或阴性细胞生长形态的变化，以及RT-PCR检测白蛋白、CK-19mRNA表达与否判断CD34<'+>及CDl33<'+>细胞转分化为肝脏细胞的情况。 1.使用组织块及消化分离法均可获得较纯的肝细胞。高糖(HG-DMEM)并含有 ITS(胰岛素／转铁蛋白／硒)的培养基较低糖(LG-DMEM)条件下，原代肝细 胞糖原储备状况明显改善，LO2正常人肝细胞株线粒体酶代谢活性更高。 2.对数生长期原代大鼠肝细胞培养上清，对因缺氧受损而处于静止期的异种肝 细胞LO2有增殖刺激作用。而对对数生长期的人肝细胞株LO2增殖刺激作用 不明显。 3.国产淋巴细胞分离液平均每毫升脐血回收MNC数量为1.24×10<'6>。使用进口 Ficoll-paque进行MNC分离，脐血MNC回收量平均为2.45×10<'6>／m1。 4.脐血中CD34<'+>细胞分布范围从平均为1.32％，CDl33<'+>细胞比率平均为0.95％。 CDl33<'+>细胞中，CD34<'+>细胞平均占90.61％，CD34<'+>细胞中CDl3<'+>细胞平均占 60.02％。 5.国产淋巴细胞分离液所获MNC进行磁分选对CD34<'+>及CDl33<'+>细胞的分选纯度为 8.06％～38.50％。使用Ficoll-paque均在57.6％以上。 6.高密度接种及高血清培养基是脐血MNC及CD34<'+>、CDl33<'+>细胞生存的基本条件。 在特定的体外诱导体系下培养至第三周时，大部分阴性细胞死亡。而CD34<'+> 及CDl33<'+>细胞可维持较好的生存状态。 7.在特定的体外诱导体系下培养至第三周时，CD34<'+>及CDl33<'+>细胞经RT-PCR检 测，尚未发现白蛋白及CKl9的mRNA表达。 结论：高糖及含有胰岛素的培养环境更适宜肝细胞的生长。在大鼠乳鼠肝细胞培养上清中含有可刺激肝细胞增殖的因子，可诱导缺氧受损处于静止期的LO2正常人肝细胞株进入分裂周期。严格按厂家说明进行操作是确保MiniMACS分选纯度的关键。在无特异性造血干细胞支持和扩增体系中，进行HSC体外培养，细胞表现出高血清培养基和高细胞密度的依赖性，在相同诱导分化条件下，CD34<'+>及CDl33<'+>细胞均表现出更持久的活力和一定增殖能力。在目前实验条件下培养至第3周时，尚未发现CD34<'+>及CDl33<'+>细胞有成熟肝细胞及胆管上皮细胞特征分子的表达。

目录

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摘要

符号说明

前言

第一部分 肝细胞培养

第二部分 脐血CD34+及CD133+细胞的体外诱导分化

附图

附表

综述 造血干细胞转分化为肝脏细胞的研究进展

参考文献

致谢