杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多样性与自身免疫性甲状腺病关联性的研究

摘要

背景：自身免疫性甲状腺病(Autoimmune thyroid dieases，AITD)是一组器官特异性自身免疫性疾病。自身免疫性甲状腺病主要包括Grayes病(Gravesdisease，GD)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)、特发性粘液性水肿(idiopathic myxedema，IM)、Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO)和产后甲状腺炎(postpartum thyroiditis，PPT)等疾病。自身免疫性甲状腺病是人群中最常见的自身免疫性紊乱之一，在女性患病率2％～4％，男性约1％。其中Graves病和桥本甲状腺炎属于内分泌系统的最常见的自身免疫性疾病，在人群中的发病率逐年增加，是我国的常见病和多发病，严重危害人民群众的健康。 目前认为，自身免疫性甲状腺病属于T细胞功能紊乱所致的一类器官特异性自身免疫性疾病，它的发生是遗传、环境因素共同作用的结果。作为器官特异性自身免疫性疾病，免疫机制在自身免疫性甲状腺病的发病中有着重要的作用。研究认为，在自身免疫性甲状腺病的发生机制中，存在抑制性T细胞功能缺陷的遗传背景，在各种环境因素的作用下，自身免疫耐受被破坏，辅助性T细胞异常激活，从而引发一系列针对甲状腺的自身免疫反应，既有细胞免疫，也有体液免疫的参与，包括自身抗体的产生，细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的功能失调，炎性细胞因子的大量产生释放，以及细胞凋亡的失控等免疫紊乱，最终导致甲状腺功能和结构的改变。 自身免疫性甲状腺病中的不同疾病可在同一个体同时或先后出现，提示它们之间可能存在共同的发病基础；但疾病的临床表现和病理改变又各有特点，故又可能各有不同的发病机制。 Graves病和桥本甲状腺炎是自身免疫性甲状腺病中最主要的两种疾病。它们发病机制中既有共同的之处，又有不同之处。Graves病是甲状腺机能亢进症的最常见原因，甲状腺内有淋巴细胞浸润，伴有甲状腺实质的增生肥大，该病发病的免疫机制中，以Th2型，即体液免疫介导的免疫反应为主，异常活化的辅助性T细胞活化自身抗原特异性B细胞，产生大量自身抗体，主要是TSAb，与TSH受体结合，刺激甲状腺激素的大量合成，并引起甲状腺的增生，从而导致甲亢发生。而桥本甲状腺炎是甲状腺功能减低最常见的原因，甲状腺的病理改变主要以淋巴细胞浸润，甲状腺滤泡的破坏及纤维化为主，自身免疫反应以Thl型，即细胞免疫为主，免疫紊乱的中心环节是活化的辅助性T细胞产生Thl型细胞因子，通过增强细胞毒作用及细胞凋亡，造成甲状腺细胞的消减，对甲状腺组织造成破坏，可导致甲状腺功能减退。对Graves病和桥本甲状腺炎的研究发现，患者的甲状腺和外周血中的NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的活性，T细胞亚群的分布，细胞因子的水平均有异常改变，并且在Graves病和桥本甲状腺炎中存在差别。但是二者的启动与发展均与自身免疫耐受的破坏，辅助性T细胞的异常激活有关。Graves病和桥本甲状腺炎的自身免疫反应的启动和发展的确切机制尚未完全阐明。大量的相关研究证明，遗传因素在自身免疫性甲状腺病的发生中发挥主要的作用，并且发现了多个遗传易感基因，多数是免疫调节相关的基因，如HLA、CTLA-4等，但是未发现确定的致病主效基因，还需要进一步研究。 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immlmoglobulin-like receptors，KIR)是NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异性识别人类主要组织相容性抗原MHC-I类分子的受体，是继HLA后发现的具有高度多样性的免疫调节基因家族，对NK细胞和T细胞具有重要免疫调节作用。KIR根据功能分为抑制性和活化性两类受体。它们的膜外区有Ig样结构域，属于免疫球蛋白超家族。编码KIR的基因位于染色体19q13.4，是具有高度多样性的多基因家族。到目前为止，KIR基因家族已发现14个编码基因和2个假基因，KIR基因的多样性除等位基因多态性外，还包括单倍型(haplotype)组成基因的多样性，不同的个体具有不同的KIR基因数目及种类，这类似于HLA-DR的基因多态性，是KIR基因多样性的特征。单倍型根据基因成分的不同分为A和B两类。因而KIR基因家族具有更丰富的多样性。虽然KIR在NK细胞和T细胞的表达是克隆性的，但个体的基因型是其表达的决定性因素。KIR在调节NK和T细胞的免疫活性方面有重要作用，已有研究发现KIR基因多样性与多种自身免疫性疾病发病相关。 目的：Graves病和桥本甲状腺炎是自身免疫性甲状腺病中最主要的两种疾病，对Graves病和桥本甲状腺炎患者免疫调节基因-KIR基因多样性进行分析，以探讨KIR基因多样性和自身免疫性甲状腺病是否存在关联性。 方法： 1．首先选取96名Grayes病患者和96名年龄、性别相配比的健康对照，采集外周静脉全血，抽提基因组DNA，然后应用PCR/SSP的方法，设计序列特异性引物对KIR基因家族的11个KIR基因(包括KIR2DL1-3，2DL5，2DS1-5，3DL1和3DS1)进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳的结果，对患者和对照组人群11个KIR基因的基因频率、基因型频率进行分析比较； 2．选取100名桥本甲状腺炎患者和260名年龄、性别相配比的健康对照，应用PCP/SSP的方法，对KIR基因家族的15个KIR基因(包括KIR2DL1-5，2DS1-5，3DL1-3、3DSl以及2DP1)进行扩增(除KIR2DS5基因外，每个基因均应用2对不同的序列特异性引物)，根据凝胶电泳的结果，对患者和对照组人群15个KIR基因的基因频率、基因型频率进行分析比较。 结果： 1．Graves病患者组与正常人群的比较： ①KIRDS4基因的基因频率在Graves病患者组显著低于对照组(0.5 vs0.856，p<0.001)： ②基因型KIR2DL3-2DL1-3DL1的基因型频率在Graves病患者组显著高于正常对照组(6.25％vs 0％，P<0.05)；基因型KIR2DL3-2DL1-3DL1-2DS4的基因型频率在Graves病患者组显著低于正常对照组(10.42％vs 28.13％，P<0.01)，这两种基因型的组成基因的差别在于KIR2DS4基因的有无。 2．桥本甲状腺炎患者组与正常人群的比较： ①桥本甲状腺炎患者组的KIR2DL5基因频率明显低于正常对照组，差异有显著性意义(0.2 vs 0.312，P<0.01)： ②有2种基因型在桥本甲状腺炎患者组显著高于正常对照组(P<0.05)。这两种基因型的组成基因中不包括KIR2DL5基因在内。 结论： 1．活化性KIR基因KIR2DS4的基因频率在Graves病患者中低于正常人群，可能是Graves病发病的保护基因。活化性KIR与抑制性KIR在NK细胞表面的平衡状态可以影响NK细胞的免疫活性。活化性KIR的减少，可能导致NK细胞的免疫活性的减弱，包括杀伤活性和细胞因子的产生能力。而活化的NK细胞对T细胞依赖的B细胞的增殖和产生抗体的能力有抑制作用。故NK细胞的免疫活性减弱可能对B细胞的增殖及自身抗体的产生起允许作用，从而导致TSAb等自身抗体的过度生成，在Graves病的发生及维持方面发挥作用。 2．抑制性KIR基因KIR2DL5的基因频率在桥本甲状腺炎患者中低于正常人群，可能是桥本甲状腺炎发病的保护基因。抑制性KIR可抑制NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的杀伤活性以及产生细胞因子的能力，并且可诱导活化T细胞的凋亡，抑制T细胞的增殖。抑制性受体KIR2DL5的减少，致使抑制性和活化性受体的失衡，可能降低了NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的活化阈值，杀伤活性增强，并促进其增殖，产生IFN—γ、TNF—α等细胞因子增多，还可使诱导活化T细胞的凋亡能力减弱，导致甲状腺内大量活化T淋巴细胞浸润，甲状腺细胞免疫性损伤，从而在HT的发生发展中发挥作用。 3．Graves病和桥本甲状腺炎虽然同属于自身免疫性甲状腺病，都是在遗传免疫缺陷的基础上发生的自身免疫紊乱，但二者的病理和临床表现截然不同，说明它们有不同的免疫发病机制。在本研究中，分别对这两种疾病与KIR基因多样性的关联性进行了研究，发现二者均与KIR基因相关，但是与它们相关联的KIR基因不同，其编码产物在调节免疫方面的功能相反，分别发挥活化性和抑制性作用。这可能与疾病发生发展过程中，辅助T细胞介导的Thl和Th2两种不同类型反应在两种疾病中的优势地位不同有关。

目录

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符号说明

前言

第一部分杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多样性与Graves病的关联性

第二部分KIR基因多样性和桥本甲状腺炎的关联性研究

致 谢

攻读博士学位期间发表的论文