骨髓间质干细胞诱导分化内皮细胞进行同种瓣体外受体内皮化的初步研究

摘要

同种瓣(homologous valve，HV)是心血管外科手术中的重要替代材料，具有其他材料所无法比拟的优点。但作为一种异体组织移植，术后的免疫排斥反应导致其晚期钙化、失功，远期效果欠佳。HV的内皮细胞(Edothelial cells，Ecs)具有细胞屏障、内分泌、抗血栓等多种作用，保留Ecs，可提高同种瓣使用寿命，但Ecs又是同种瓣组织中免疫原性最强的部分，易引起HV的免疫衰败。如果去除Ecs，致使HV内皮下纤维直接暴露在受体血液中，则同样会发生钙化、衰败。如何保持HV结构与功能的完整性，提高耐久性，又要减低免疫衰败率，一直是国内外研究的一个热点和难题。 应用受体Ecs来代替HVECs，理论上可以解决上述难题。目前国内外研究中获得HV组织表面内皮化的方式有两种：体内内皮化和体外内皮化。体内内皮化是将预处理的HV组织移植到体内后由受体自身Ecs生长爬行覆盖；体外内皮化是将体外培养的受体Ecs种植到同种瓣表面以达到内皮化。前者在内皮化过程中仍然要受到受体免疫排斥，后者目前多以脐静脉、大隐静脉、颈外动静脉和胸主动脉等作为种子细胞来源，但均要牺牲受体血管的完整性，同时，也增加了外科医生的操作，以及患者的创伤和相应费用。此外，来源于自体血管成熟的Ecs在体外进入增殖期4～6周后增殖活性即逐渐下降，特有的功能逐渐丢失，难以达到临床需要。因此，在一定程度上，种子细胞的研究工作是目前．HV内皮化研究中的一个限速过程。 骨髓间质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一类成体干细胞，具有跨系统、跨胚层分化的潜能，在特定条件下可以诱导分化为成多种类型的细胞。最近的研究显示MSCs经特殊处理后可以分化为血管内皮细胞。如将受体的MSCs诱导分化为Ecs并种植到液氮保存的同种瓣上，将有可能解决既保持同种瓣结构与功能的完整性，提高耐久性，又要减低免疫衰败率的难题。 为解决解决上述难题提供一个简便、可行、有效的方法，本课题系统研究了MSCs的分离、培养及其生物学特性和体外向Ecs诱导分化的条件，并以MSCs为种子细胞，在去除了Ecs的HV瓣叶上进行受体Ecs种植和体外培养，对HV体外受体细胞化进行了初步研究。 一、MSCs的分离和培养是进行MSCs研究并对其进行诱导分化的前提，因此本课题首先进行了这方面的实验研究(论文的第一部分实验一)。 MSCs在新鲜的成人骨髓中的含量很少，仅占骨髓单个核细胞的百万分之一到十万分之一，因此要获得足量的MSCs，体外细胞培养条件下进行分离、纯化和扩增是十分必要的。根据MSCs密度比较低和容易贴壁生长的特点，本课题采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法，首先用PercoⅡ分离液经过梯度离心去除大部分的造血细胞，再通过贴壁培养、换液去除悬浮生长的造血细胞，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养扩增。结果显示，经梯度离心获得的细胞，原代培养4d时即可形成由BMSCs组成的细胞集落；约7～8d时，集落内细胞密集，细胞分裂相减少；用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA传代培养，传代细胞增殖较快，约5d可传一代，传至3代时细胞基本纯化，随着传代次数的增加，细胞增殖速度逐渐变慢。 由于MSCs同时具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的表面抗原标志，缺乏专一的特异性抗原标志，因而目前尚无特异方法直接鉴定MSCs，都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为MSCs。本课题中通过流式细胞仪检测结果表明，我们所分离、培养的大鼠骨髓MSCs的细胞膜表面表达整合家族成员CDl3、CD29、CD44和CD105有阳性表达，而这些抗原是造血干细胞表面没有的，但作为造血前体细胞的表面标志抗原CD34、和白细胞标志性抗原CD45在所培养的细胞表面呈阴性表达，证明所培养的细胞不是骨髓中的造血干细胞，而是MSCs。 二、MSCs要诱导分化为ECs才能对HV进行再内皮细胞化。本课题中第一部分实验二对MSCs体外定向诱导分化为ECs进行了系统的实验研究。决定MSCs分化方向的关键是诱导分化的条件。在体内，组织干细胞的发生及功能获得与组织中基因编码的转录因子和细胞外信号转导有关，体外组织干细胞的定向分化机理尚不十分清楚，但血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)是诱导MSCs分化为ECs的关键所在。本课题中我们选取了生长状态良好的第3至第10代MSCs作为诱导对象，建立了MSCs定向诱导分化内皮细胞的诱导培养体系。在该培养体系中，VEGF是MSCs定向分化为内皮细胞的关键所在，碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)作为一种激素样多肽，协同’VEGF，能提高ECs克隆的形成和增殖；L-谷氨酰胺作为一种营养添加剂促进ECs的生长和增殖。 为验证所诱导分化的细胞即是ECs，实验中进行了细胞形态学、免疫组织细胞学和免疫荧光等一系列检测。结果表明，在诱导分化的细胞中Ⅷ因子相关抗原、CD31、Tie表达均成阳性表达，Dil—AcLDI，吞噬试验阳性，显微镜可见诱导后细胞立体感增强，形态不固定，细胞呈扁平、大多角形、长梭形、圆形、椭圆形或板状，边界清晰，大小均匀，细胞有丰富的胞浆和不规则突起，胞核圆形或椭圆形。TEM下观察诱导分化的细胞核染色体细而均匀、核仁小而圆、缺少窗孔结构，线粒体噬锇性增大、变长或扭曲，胞浆充满大量微丝，这都是ECs的超微结构特点，尤其明显的是，胞浆中含有内皮细胞特有颗粒Weible-Palade小体，证实了骨髓MSCs体外在一定的诱导条件下，能够定向分化为ECs，也说明我们的诱导培养体系是有效的。 三、要进行HV的受体再细胞化，首先要去除HV原有的ECs。本课题第二部分实验三对此进行了研究。 本研究中我们参考国外研究者的方法，并进行改进，对经液氮保存6个月～3年的人同种主动脉瓣进行脱细胞实验。选用质量浓度为0.03％的阴离子细胞洗涤剂SDS去除瓣叶活性ECs。配制的低渗和等渗的缓冲液采用螯合配体Tris，并加入基质金属蛋白水解抑制剂EDTA和广谱丝氨酸蛋白水解酶抑制剂抑肽酶，用来保护细胞外基质。上述各组液体按步骤与HV瓣叶组织共同孵育达48小时。实验结果显示，光镜和SEM下观察内皮细胞完全被脱去，而中心部位的成纤维细胞有一部分被保留了下来；弹力纤维和胶原纤维在脱细胞前后均无明显改变，其形态结构保持良好；通过人类白细胞抗原免疫组化染色观察也证实免疫原性较强的ECs基本被完全去除，使处理后的瓣叶HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗原表达呈阴性，也说明处理后的瓣叶免疫原性显著降低；通过对瓣叶的生物力学分析，显示处理后的HV瓣叶与未处理的HV瓣叶在厚度、弹性模量、极限抗张力强度、断裂伸长率、应力松弛率等各指标中均无差别，说明本课题所采用的去内皮细胞方法基本可以达到既免除HV组织的免疫原性、又保留基质结构成分并保持组织生物力学特性的要求。 四、本课题的第二部分实验四应用受体MSCs体外诱导分化的Ecs作为种子细胞，对HV的体外受体细胞化进行了初步尝试。 在第一部分研究的基础上，采用相同的方法，对人MSCs进行分离、纯化、培养、扩增，并在体外定向诱导分化为Ecs，并将其高密度种植于采用第二部分实验三的方法脱去Ecs并应用纤维连接蛋白进行预覆盖的人同种主动脉瓣瓣叶上，高糖DMEM培养液下培养24h，重复种植细胞1次，继续静态培养21天，进行组织学、免疫组织化学和电子显微镜检查。结果显示，瓣叶再细胞化达到95％以上，SEM下瓣叶表面的细胞呈卵圆形或长梭形，单层排列，立体感较强，排列较紧密，典型的“鹅卵石”特征，Ⅷ因子免疫组化染色呈阳性。本课题基本实现了HV体外再内皮化构建的预期目标，为下一步脉动流培养提供了材料基础。 本课题研究结果为HV受体内皮细胞化的进一步研究并最终应用于临床奠定了基础，但这仅仅是研究的一个开端，尚有极大的后续研究空间。随着生物工程学、细胞生物学、分子生物学的进展，组织培养、种植技术的成熟，新型、个体特异的组织工程同种心脏瓣膜将逐渐完善，将以独特的优势、理想的特性广泛应用于临床，提高瓣膜疾病和复杂先天性心脏病的治疗效果，提高病人的生活质量，延长病人寿命。

目录

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第一部分大鼠骨髓间质干细胞体外培养和定向分化实验一大鼠骨髓间质干细胞的分离、培养及其生物学特性的观察

第一部分大鼠骨髓间质干细胞体外培养和定向分化实验二体外定向诱导骨髓间质干细胞向血管内皮细胞分化的实验研究

第二部分骨髓间质干细胞诱导分化内皮细胞移植进行人同种瓣体外再内皮化的初步研究实验三、脱内皮细胞同种瓣制备及其生物学特性观察

第二部分骨髓间质干细胞诱导分化内皮细胞移植进行人同种瓣体外再内皮化的初步研究实验四、脱内皮细胞人同种主动脉瓣体外再内皮化的实验研究

附图

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文