肿瘤坏死因子受体Ⅱ及其基因多态性与冠心病易感性关系的研究

摘要

背景与目的： 目前冠心病在我国乃至世界各国均有着极高的发病率。而对于其发 病机制，炎症学说与遗传机制越来越占据优势。肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor TNF)既是重要的促炎细胞因子之一，而其需通过与 其相应的受体结合后方能发挥作用。肿瘤坏死因子受体II(tumor necrosis factor receptor II，TNFR II)基因定位于lP36。其196位存 在ATG-AGG基因多态性，可以引起甲硫氨酸→精氨酸的置换。Sankar VH 等人研究发现TNFR II基因第6外显子196位点的基因多态性与冠心病的 发生密切相关。而ALLEN RA等人研究认为TNFR II基因多态性与CHD发 病无相关性。这可能与不同种族基因型不同有关。在中国尚未见有关 TNF R II基因第6外显子196位基因多态性与冠心病易感性关系的报道。 本研究主要从参与血管损伤的TNFR II的突变位点进行分析，并对基因 位点的多态性与冠心病的相关性进行初步探讨。旨在通过筛查炎症因，子中的危险因素来发现冠心病的危险人群，以进一步促进早期预防和 给予个性化治疗。主要目的如下： 1．应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)结合琼脂糖凝胶电泳技术检测肿瘤坏死因子受体II(TNFR II)第六外显子基因多态性； 2．明确山东地区健康及冠心病(CHD)的汉族人群肿瘤坏死因子受体II基因第六外显子的基因型(Genotype)和等位基因(A11ele)的分布特征； 3．应用ELISA法检测血清中的sTNFR II水平，并结合其基因型和血脂水平进行综合分析，判断肿瘤坏死因子受体II基因突变位点与血清可溶性肿瘤坏死因子受体II水平及血脂的关联程度； 4．用病例对照研究的方法探讨肿瘤坏死因予受体II第六外显子基因多态性与冠心病易感的相关性。 对象： 1．冠心病组(CHD)共105例，男性80例，女性25例，平均年龄58.2±10.4岁。全部选自山东大学第二医院和齐鲁医院心内科住院病人，诊断符合1979年国际心脏病学会(ISFC)和世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的临床诊断标准。排除标准：具有冠心病家族史、明显的感染性疾病、肿瘤、及免疫系统的疾病的人作为排除对象。 2．健康对照组(Control)105例，男79例，女26例，平均年龄54.6±11.3岁，根据病史、体检、心电图、X线或CT/MRI、实验室检查及选择性冠状动脉造影检查，从门诊或病房住院患者中选取。两组间年龄、性别构成比差别无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。 所有研究对象均来自山东地区汉族人群，无血缘关系。 方法： 1．从试验对象的外周血白细胞中提取基因组DNA，PCR扩增其TNFRII包括编码196位氨基酸残基在内的第六外显子基因，扩增产物用限制性内切酶N1a Ⅲ酶切后进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用溴乙淀染色，紫外灯下直接观察TNF RII的基因型。2．利用酶联免疫吸附实验方法测定试验对象外周血浆中sTNF RII浓度。统计学分析： 计算CHD患者TNFR II基因型和等位基因频率采用直接计数法统计，利用x<'2>检验对所得的数据进行分析。一般临床资料中计量资料均采用均数标准差( ±s)表示，组间统计学差异用t检验。TNFR II基因型与sTNFR以及临床表现和实验室检查之间的比较用回归分析。以P<0.05为差异有显著性。用SPSS 13.0软件包进行统计计算。 结果：1．应用PCR-RFLP结合琼脂糖凝胶电泳技术检测到符合要求肿瘤坏死因予受体I I(TNFR I I)第六外显子基因型。经过Nlalll酶切及电泳后显示：MM基因型两条带，MR基因型三条带，RR基因型一条带。 2．比较冠心病组和对照组的临床特点两组间平均年龄、总胆固醇水平无显著性差异(P>0.05)：冠心病组低密度脂蛋白水平，甘油三脂水平，高血压，糖尿病及吸烟患者比例高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。 3．CHD组和健康对照组的TNF RII第六外显子各等位基因的频率，在性别之间的频率分布无显著差异。(两组等位基因之间：X<'2>=0.243P=0.76)，合并样本数后，山东地区健康汉族人TNF R2第六外显子各基因型的频率为：196M/M 71.4％，196M/R26.7％，196R/R1.9％;等位基因频率为：196M 84.8％，196R 15.2％。 4．CHD患者TNFRII基因型196R的等位基因频率(24.8％)明显高于对照组(15.2％)，P<0.05，携带196R的个体发病危险性大(X2=5.89，p=0.015；OR=2.9，95％可信限：1.2-5.8)。 5．将CHD临床表现和实验室检查分为TNFRII196R<'+>组(包括196R/R纯合子和196M/R杂合子)和TNFRII196R<'->(TNFRII196M/M纯合子)。各临床表现和实验室检查两组之间无明显差异(P>0.05)。 6．血浆sTNFRII水平的测定：sTNFR浓度在CHD患者组比健康对照组明显升高(P<0.05)。 7．利用单因素和Logistic回归分析发现TNFRII基因型196位点基因多态性是冠心病发病的独立危险因素。 8．TNF-RII基因型和sTNFR水平之间无明显的关联。 结论： 1．山东地区健康汉族人TNFRII第六外显子各基因型的频率为：196M/M 71.4％，196M/R 26.7％，196R/R 1.9％;等位基因频率为：196M84.8％，196R 15.2％。2．CHD组TNF RII第六外显子各等位基因的频率与病例对照组相比存在显著差异。利用单因素及多因素回归分析可以证明TNF RII第六外显子196位基因多态性与CHD的易感性相关，是冠心病发病的独立危险因素。3．sTNFRII在病例组明显高于对照组。4．sTNFRII与TNFRII第六外显子各等位基因型之间无明显的关联。

目录

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引 言

材料与方法

结 果

讨 论

结论

附录

参考文献

致谢

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