半边莲生物碱和山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖作用的机制研究

摘要

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖是动脉硬化(atherosclerosis，AS)、原发性高血压(primary hypertension，EH)、经皮冠状动脉腔内血管成形术后再狭窄的病理基础，因此探讨抑制VSMCs增殖的药物成为人们研究的热点。近来的研究表明，血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VEC)释放的内皮素(endothelin，ET)具有强烈的缩血管作用。除了收缩血管作用外，ET还能够激活有丝分裂原活化的蛋白激酶，刺激c-fos和c-myc的表达而使VSMCs肥大和增殖。 ET是一族生物活性多肽，目前发现生物体内有4种形式的异型体，分别称为ET-1、ET-2和ET-3及血管活性肠收缩物质(Vasoactive intestinal contractor peptide，VIC)，其中生物活性以ET-1最强。ET与自然界存在的某些生物毒素有一定亲缘关系，包括蛇毒、蝎毒和蜂毒等。Sarafotoxins(SRTX)是从蛇毒中提取的一种毒素，与ET具有共同的祖基因和相似的生物学活性，一级结构具有明显的同源性，至少有60％～80％氨基酸同源，而且有相同的C-末端。研究证实，ET的c-末端特别是Tm21，两个二硫键，氨基和羧基端，以及Asp8和Glu10的羧酸组对它的生物学活性起了重要的作用，构成了SRTX和ET表面的“共同和基本”的生物活性位点。SRTX和ET构成一组同源性异构肽家族，竞争性结合相同的G蛋白偶联受体，通过IP<,3>、Ca<'2+>、钙调蛋白激酶途径，引发各类生物学效应，因此可能从抗蛇毒中药中寻找防治动脉硬化、高血压等ET相关性疾病的药物。 民间早就流传抗蛇毒药徐长卿治疗高血压的偏方，1993年，张继峰等对抗蛇毒药物：徐长卿、半边莲和七叶一支花等做了初步的研究。通过离体血管条和整体动物实验发现半边莲和七叶一支花水提物可部分拮抗ET-1致小鼠的死亡作用，并可以抑制ET-1的缩血管和升压效应。王峰等对抗蛇毒中药红背丝绸进行研究发现，红背丝绸的醇提物、乙酸乙脂提取物和红背丝绸单体CA-1201对ET-1致小鼠的死亡均有保护作用；可剂量依赖性地拮抗ET-1致大鼠胸主动脉的缩血管效应；可明显抑制ET-1引起的家兔胸主动脉血管平滑肌细胞增殖，并呈浓度依赖性；CA-1201在一定程度可以拮抗[<'125>I]>ET-1与血管平滑肌成纤维细胞的结合。 1999年，我室胡维诚和杜艳芝等观察了具有抗蛇毒作用的清热解毒液(主要含半边莲、蚤休、赤芍、陈皮等)对高脂饮食所引起的VEC损伤的保护作用。发现清热解毒液在不降低高脂血症大鼠血清胆固醇和甘油三酯的情况下，可减轻VEC受损，同时使VEC合成和释放ET-1减少，在一定程度上起到保护VEC的作用。本课题组进而分别提取半边莲有机酸和生物总碱，以及蚤休皂甙，发现半边莲生物总碱能通过拮抗ET-1合成与释放，明显缓解高脂血症对血管内皮的继续损伤并可显著抑制高脂血症大鼠主动脉中膜VSMCs增殖。提示半边莲生物总碱可能是半边莲生药中的有效成分。 为了进一步探讨半边莲对VSMCs增殖的抑制机制，并进一步明确其有效成分，我们提取半边莲生物碱(Lobelia Chinensis Lour Alkaloid，LCLA)，并同时应用其主要单体山梗菜碱，作用于ET-1诱导的VSMCs增殖模型，明确其对VSMCs的作用，并探讨其作用机制，为半边莲及其有效成分应用于临床治疗心血管病提供实验依据。本实验分四个部分对此进行了研究： 第一部分：建立内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖模型： 原代培养人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical arterial smooth musclecells，HUASMCs)，α-actin单克隆抗体免疫细胞化学检测证明培养的是平滑肌细胞。描绘生长曲线观察不同剂量的ET-1对HUASMCs生长的影响以确定ET-1的作用时间和作用浓度。发现培养的HUASMCs中分组加入不同浓度的ET-1后，第1天各组之间没有明显差异(P>0.05)；第2天，各浓度ET组的HUASMCs数量开始明显增多，并随着ET-1浓度的增加，HUASMCs增殖明显加快，与对照组比较有明显差异(P>0.05)，100nM、1000nM的ET-1能明显促进HUASMCs增殖，与10 nM的ET-1比较差异显著(P<0.01)，但在100nM、1000nM浓度之间比较没有明显差异(P>0.05)；第5天，各浓度组的ET-1促进HUASMCs增殖达到最大值，与对照组差异显著(P<0.01)，100nM、1000riM浓度的ET-1与10 nM浓度的ET-1比较差异显著(P<0.01)，但两者之间比较没有差异(P>0.05)。由此我们确定ET-1的作用浓度为100nM，作用时间为24h。然后我们以ETAR特异性拮抗剂BQ-123和PKC特异性抑制剂星形孢菌素(Staurosporine，ST)作为阳性对照，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测100nM ET-1作用HUASMCs 24h后对其生长的影响，以建立ET-1诱导的HUASMCs增殖模型。研究结果显示：ET-1可明显增加HUASMCs内的吸光度值，表明细胞的数目增加，增殖活性增强(P<0.01)；1000nM BQ-123和100 nM ST均可抑制ET-1所诱导的HUASMCs增殖(P<0.01)，增殖抑制率分别为33.3±0.5％和25.6±0.8％。 由此证明，100nM的ET-1与HUASMCs共同孵育24h后能显著促进HUIASMCs增殖，可作为研究血管平滑肌细胞增殖的模型。 第二部分：半边莲生物碱和山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖的影响： 提取LCLA充分溶解于DMSO中，分别配制成各浓度组LCLA溶液。首先采用台盼兰染色排斥实验检测不同浓度DMSO的细胞毒性，以排除DMSO对实验结果的影响。实验发现DMSO浓度小于0.125％时对mJASMCs无细胞毒性作用，本实验中所用液体DMSO终浓度低于0.1％，可以排除DMSO对结果的影响。为分析LCLA溶液和山梗菜碱溶液的细胞毒性我们仍采用台盼蓝染色排斥实验和检测培养液的乳酸脱氢酶(1actatedehydrogenase，LDH)含量方法。倒置显微镜下观察发现，正常对照组、50、100、200、400μg/mL 的LCLA组和10、30、100、300μM的山梗菜碱组细胞生长良好，形态正常，无细胞脱失区，无细胞碎片。台盼蓝染色排斥实验显示，上述组细胞存活率均大于95％，上清液LDH含量差异无显著性(P>0.05)。而600μg/mL的LCLA组和500μM的山梗菜碱组细胞变圆，许多细胞失去突起，细胞碎片多，细胞数目明显减少甚至消失脱落。台盼蓝染色排斥实验显示，上述组细胞存活率均小于50％，上清液LDH含量明显高于对照组(P<0.05)。然后我们将50、100、200、400μg/mL的LCLA和10、30、100、300μM的山梗菜碱与100nM的ET-1共同作用于HUASMCs，24h后采用CCK-8试剂盒计数细胞筛选LCLA和山梗菜碱的实验用剂量。发现50μg/mL的LCLA组和10μM的山梗菜碱组细胞数目与ET组比较无明显差异，100、200、400μg/mL的LCLA组和30、100、300μM的山梗菜碱组细胞数与ET组比较有显著性差异(P<0.05)，且随着药物浓度的增高，细胞数目逐渐减少。因此我们推断LCLA和山梗菜碱的作用浓度分别为100～400μg/mL和30～300μM。将上述浓度组药物以及1000nM BQ-123、100 nM ST与100nM的ET-1共同作用于HUASMCs，24h后采用<'3>H-TdR掺入、免疫细胞化学染色检测增殖细胞核抗原素(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达水平观察它们对ET-1诱导的HUASMCs增殖的影响。研究发现ET-1使HUASMCs<'3>H-TdR掺入量和PCNA的表达量明显高于对照组(P<0.01)，而ET+LCLA、ET+山梗菜碱、ET+BQ-123和ST均可降低<'3>H-TdR掺入量和下调HUASMCs的PCNA的表达率(P<0.05)，并且LCLA和山梗菜碱的抑制作用具有浓度依赖性。 因此我们得出结论：ET-1可明显促进HUASMCs增殖。100～400μg/mL的LCLA、30～300μM的山梗菜碱、ETAR特异性拮抗剂BQ-123和PKC特异性抑制剂ST均可抑制ET-1所诱导的HUASMCs增殖，LCLA和山梗菜碱的抑制作用具有浓度依赖性，且此抑制作用并非是通过细胞毒性作用实现的。 第三部分：半边莲生物碱、山梗菜碱对内皮素-1 诱导的人脐动脉平滑肌细胞细胞周期进程的影响： 本文第二部分的研究已经发现LCLA及其单体山梗菜碱可浓度依赖性地抑制ET-1诱导的HUASMCs增殖，而细胞最终通过细胞周期来完成其分裂、增生，细胞周期是被一系列细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶(Cyelin-dependent kinases，CDKs)、细胞周期蛋白激酶抑制因子(Cyclin-kinase inhibitor，CKI)进行网络调控来实现。其中CyclinD<,1>是细胞周期中G<,1>/S期转变的关键点，p21<'WAF1/CIP1>能抑制多种CDK或Cyclin-CDK的活性，所以本部分通过流式细胞仪观察LCLA及其单体山梗菜碱对ET-1诱导的HUASMCs细胞周期的改变，聚合酶链式反应(RT-PCR)半定量检测CyclinD<,1>和p21 <'WAF1/CIP1>mRNA表达的影响，进一步明确LCLA和山梗菜碱拮抗ET-1，抑制HUASMCs增殖的作用机制。将不同浓度的LCLA (100、200、400μg/mL)、山梗菜碱(30、100、300μM)和1000nM BQ-123、100 nM ST与100 nM ET-1共同培养HUASMCs 24h后，流式细胞仪显示ET-1刺激HUASMCs由静止期(G<,0>/G<,1>期)进入DNA合成期(S期)和有丝分裂期(G<,2>/M期)，其中G<,0>/G<,1>期细胞比例显著低于对照组(P<0.01)，而S期与G<,2>/M期细胞显著高于对照组(P<0.01)。LCLA、山梗菜碱、BQ-123和ST均显著缓解ET-1所致的变化(P<0.05)，LCLA和山梗菜碱具有一定的浓度依赖性。RT-PCR结果为：与对照组相比，ET-1促使CyclinD<,1> mRNA的表达量明显增加，p21<'WAF1/CIP1>mRNA的表达量明显减少(P<0.05)。与ET组相比，LCLA、山梗菜碱、BQ-123和ST均使CyclinD<,1>mRNA的表达量减少，p21<'WAF1/CIP1>mRNA的表达量增多，且随着LCLA和山梗菜碱浓度的增高，作用逐渐增强。因此认为ET-1通过推进细胞周期的进展发挥促HUASMCs增殖作用；BQ-123、ST、LCLA(100～400μg/mL)和山梗菜碱(30～300μM)拮抗ET-1所诱导的HUASMCs增殖机制不是由HUASMCs凋亡所导致的，而是通过抑制CyclinD<,l> mRNA的表达，促进p21<'WAF1/CIP1>mRNA的表达，使ET-1促进的细胞周期进程受阻，而发挥拮抗ET-1的促HUASMCs增殖作用；ETAR和PKC激活均可推动细胞周期的进展。 第四部分：半边莲生物碱、山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖调节通路的影响： 本实验的前三部分证实ET-1促HUASMCs增殖的作用与ETAR和PKC有关，LCLA和山梗菜碱都呈浓度依赖性地抑制ET-1的促HUASMCs增殖作用。Ca<'2+>作为细胞内的第二信使可激活PKC，是触发细胞增殖相关信号转导的始动因素。因此为进一步研究LCLA和山梗菜碱抗增殖的细胞内信号传导机制，在本部分我们采用激光共聚焦显微镜观察细胞内cE<'2+>浓度的改变，并采用RT-PCR方法检测LCLA和山梗菜碱对ETAR mRNA和PKCα mRNA的表达。不同浓度的LCLA(100、200、400μg/mL)、山梗菜碱(30、100、300μM)和1000nM BQ-123、100 nM ST与100 nM ET-1共同培养HUASMCs 24h后，负载Fluo-3，在488nm波长的光激发下，可观察到ET-1孵育引起HUASMCs内游离cE<'2+>浓度明显高于正常组(P<0.01)，ET+LCLA组、ET+山梗菜碱组、ET+BQ-123组、ET+ST组VSMC的Ca<'2+>浓度均显著低于ET组(P<0.05)。动态观察HUASMCs内的Ca<'2+>荧光显示，100 nM ET-1刺激细胞游离Ca<'2+>呈双相变化：先快速增加到峰值，峰值荧光变化之后迅速下降并维持于平台期。分别加入200 μg/mL的LCLA、100μM山梗菜碱、1000nM BQ-123、100 nM ST预孵育5min后，再加入100 nM ET-1，HUASMCs内Ca<'2+>荧光强度上升到峰值的幅度减小，平台期与静息Ca<'2+>荧光强度之间的变化也小于ET组(P/VKC信号传导途径参与了ET-1促HUASMCs的增殖过程；LCLA和山梗菜碱抑制ET-1对HUASMCs促增殖作用的机制为两者均阻碍了ET-1促HUASMCs的信号传导通路：ETAR/CE<'2+>/PKC信号传导途径。山梗菜碱是半边莲生物碱中抑制HUASMCs增殖的有效成分。

目录

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符号说明

第一部分建立内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖模型

第二部分半边莲生物碱和山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖的影响

第三部分半边莲生物碱、山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞的细胞周期进程的影响

第四部分半边莲生物碱、山梗菜碱对内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖调节通路的影响

总结

抗蛇毒中药防治高血压病的研究进展

致谢

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