1.异种胰岛移植中巨噬细胞免疫排斥及调节的研究；2.GLUT1及Ang1与糖尿病视网膜病变关系研究

摘要

全文分为二部分： 第一部分 异种胰岛移植中巨噬细胞免疫排斥及调节的研究 一、活化巨噬细胞特异性识别并排斥猪异种胰岛移植物 目的:建立混合移植的糖尿病小鼠模型，以寻找支持活化的巨噬细胞能够特异性的识别并排斥猪胰岛细胞的更直接的证据。 方法: 1.胰岛移植与巨噬细胞重建：STZ诱导的糖尿病NODSCID小鼠分别接受：Balb/c小鼠的胰岛移植(A1loTx组)，混合移植(MixTx组)(左侧接受小鼠胰岛与NICC的混合移植物，右肾接受NICC异种重建后移植物)和NICC异种移植。用CD4+T细胞活化的巨噬细胞重建接受同种移植及混合移植的NODSCID，重建后第5周取出混合移植物，第8周处死所有小鼠。实验过程中检测血糖。 2．对组织块进行形态学观察及胰岛素、F4/80巨噬细胞免疫组化染色，观察移植物。 结果: 1．血糖变化AlloTx组和MixTx组，在胰岛移植后血糖明显下降，巨噬细胞重建后血糖仍然维持正常重建后第5周，MixTx组小鼠混合移植物被取出，血糖上升，明显高于AlloTx组小鼠。 2．组织学观察H&E染色显示，AlloTx组小鼠肾被膜下可见完整的小鼠胰岛。在MixTx组小鼠的左肾组织，还可以见到完整的胰岛组织，但是在右肾，未见胰岛结构，可见大量的细胞浸润。在NICC对照组异源性胰岛组织清晰可见。 3．免疫组化在AlloTx组，胰岛素染色可见棕色的阳性颗粒。在MixTx组，左肾可见清晰的胰岛素染色阳性，而在右肾，胰岛素几乎没有阳性颗粒，在NICC对照组可见大量的胰岛素阳性染色。巨噬细胞染色，在AlloTx组，仅可见少量阳性染色，在胰岛内部，看不到任何阳性颗粒，在MixTx组，左肾可见巨噬细胞浸润，但是没有侵蚀到胰岛内部。巨噬细胞在右肾被膜下大量浸润。 结论: 1．本实验直接证明在猪异种胰岛抗原存在的情况下，用CD4+T细胞活化的巨噬细胞可以特异性的识别并排斥猪异种胰岛移植物。 2．活化的巨噬细胞可以从外周自动聚集至移植物局部。 3．这种特异性识别的具体作用机制需要进一步研究。 二、人CD4+CD25+调节性T体外抑制猪异种抗原引起的巨噬细胞活化 目的:以前的研究显示，体外扩增的Tregs可以抑制T细胞介导的针对猪异种抗原的免疫反应，在本实验中，本文利用扩增的Tregs，研究其对异种细胞激活的巨噬细胞是否具有抑制作用以及可能的机制。 方法：新鲜Tregs、CD14+单核细胞、去CD4+细胞的PBMC细胞，均来自健康志愿者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用含10﹪FCS，Anti-CD3/CD28 beads，IL2及Rapamycin的RPMll640培养液体外扩增，培养2至3周的细胞用于下游实验。经射线照射的猪PBMC(PIG)作为异种抗原。实验中有3个培养体系：1.PBMC体系分PBMC、PBMC+PIG、PBMC+PIG+Tregs三组，Transwell用于第四组，将Tregs与PBMC+Pig细胞隔开培养。2．CDl4+细胞体系分CDl4+细胞、CDl4+细胞+PIG、CDl4+细胞+PIG+TIregs三组。3．去CD4+PBMC体系分去CD4+PBMC、去CD4+PBMC+PIG、去CD4+PBMC+PIG+Tregs三组。每组细胞的共培养比例均为1:1:1。48小时之后，收集细胞做标志分子及凋亡染色，做流式细胞术分析。 结果: 1．在PBMC培养系统中，CD14+细胞的CD40、IL12及TNF，加入猪异种抗原之后，较PBMC单独培养组的明显增加，在与Tregs共培养组，表达下调，组间差别有统计学意义。在CD14+培养体系及在去CD4+PBMC体系中这些分子的表达在三组间没有差别。 2．Transwell与PBMC+PIG组相比，CD40的表达在Transwell组没有下降，IL12和TNF-α在Transwell组有下降的趋势，但是统计分析显示没有明显的差异。 3．细胞凋亡本实验比较了PBMC+PIG组和PBMC+PIG+Treg组的细胞凋亡情况，统计学显示两组间没有显著性差异。 结论: 1．通过减少巨噬细胞表达活化标志分子而不是诱导巨噬细胞死亡，人Tregs可以抑制异种抗原引起的单核/巨噬细胞激活。 2．在巨噬细胞激活的过程中，需要CD4+T细胞的参与，Tregs或许通过对CD4+T细胞的抑制来实现对巨噬细胞的调节。 3．Tregs需要通过细胞接触实现对巨噬细胞的抑制。 4．Tregs是否能够抑制巨噬细胞在猪异种移植免疫反应中的功能以及作用机制尚待阐明。 第二部分 GLUT1及Ang1与糖尿病视网膜病变关系研究 目的:已知Angl可通过Tie2受体调节Akt的活性，而Akt又可调节GLUTl活性，那么，GLUTl与Angl在糖尿病视网膜中表达部位及数量究竟如何；在糖尿病视网膜病变中是否有一定的作用：Angl能否通过Akt来调节GLUTl的表达，进而影响视网膜的糖代谢过程?本研究将检测糖尿病大鼠视网膜中Angl与GLUTl的含量，为临床诊断治疗提供理论依据。 材料与方法： 健康雄性Wistar大鼠40只，体重180-220g。随机选出10只作为正常对照组(NC组)，另外30只采用链脲佐菌素(STZ)溶液腹腔一次性注射建立糖尿病模型(成模20只)，确定成模后随机分为2组：糖尿病血糖未控制组(DMl组)和糖尿病血糖控制组(DM2组)，每组10只。利用腹腔内注射鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)将2个糖尿病组大鼠血糖分别控制在>16.7mmol/L,和<14 mmol/L两个水平。标准饲养3个月后取血测定糖化血红蛋白(HbAlc)，并分离大鼠视网膜，利用免疫组化方法进行GLUTl蛋白的检测，用逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测mRNA含量。统计学分析：所有数据均以均数士标准差(X±SD)表示，采用SPSS11.0软件处理。样本间均数的比较采用t检验，变量间的关系采用直线相关分析。P<0.05表示有统计学意义。 结果： 1、实验期间DM1、DM2两组糖尿病大鼠体重明显低于NC组大鼠同期体重，而血糖和糖化血红蛋白(HbAlc)则显著高于NC组大鼠。 2、免疫组化染色显示NC组大鼠视网膜中可见GLUT1阳性染色颗粒，DM1组、DM2组大鼠视网膜中GLUT1阳性染色颗粒明显增加，且DM1组比DM2组增加更明显。 3、RT-PCR结果显示三组大鼠视网膜中均含Angl及GLUT1 mRNA。与NC组相比，DM1组大鼠视网膜内Angl及GLUT1 mRNA表达增加，DM2组大鼠较DM1组下降，差别均具有统计学意义(p<0.01)。 结论： 1、糖尿病高血糖状态下，大鼠视网膜中GLUT1蛋白表达较正常对照组增加，尤以血糖未控制组增加明显。糖尿病病程中，视网膜中GLUT1表达并未降低。 2、糖尿病高血糖状态下，Wistar大鼠视网膜中Angl及GLUT1mRNA含量较正常对照组增加。用胰岛素控制血糖后含量有所下降。

目录

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论文一 异种胰岛移植中巨噬细胞免疫排斥及调节的研究

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文献回顾

论文一第一部份活化巨噬细胞特异性识别并排斥猪异种胰岛移植物

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

论文一第二部份人CD4+CD25+调节性T体外抑制猪异种抗原引起的巨噬细胞活化

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

论文二 GLUT1及Ang1与糖尿病视网膜病变关系研究

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文献回顾

前言

材料与方法

结果

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结论

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