诃子汤制草乌对心肌细胞毒性损伤及减毒机制研究

摘要

本课题以毛茛科植物北乌头的干燥块根（蒙药“泵嘎”）为研究对象。用蒙医传统炮制方法诃子汤炮制草乌，乙醚分别提取生草乌和诃子汤制草乌中的总生物碱。以原代培养的乳大鼠心肌细胞为对象研究生草乌、诃子汤制草乌总生物碱对心肌细胞的毒性;以细胞存活率（MTT法）、细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率等指标反映细胞毒性变化;采用Hoechst33528荧光染色法和AnnexinV/PI双染色法研究心肌细胞凋亡;并用流式细胞仪检测心肌细胞[Ca2+]i变化，研究诃子汤制草乌对心肌细胞毒性损伤及减毒机制研究。
　　 心肌细胞毒性机制的研究:制备乳大鼠原代心肌细胞，细胞平均存活率≥91％，经免疫组织化学染色鉴定，小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白为阳性而兔抗大鼠纤连蛋白多克隆抗体为阴性。将诃子汤制草乌总生物碱和生草乌总生物碱给予心肌细胞，共同孵育30min、60min，结果发现两者均能降低心肌细胞活力，细胞LDH漏出率增加，发生细胞凋亡，产生细胞毒性;生草乌总生物碱对心肌细胞存活抑制率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率均强于诃子汤制草乌总生物碱(P＜0.01);且生草乌总生物碱致使心肌细胞的凋亡率高于诃子汤制草乌总生物碱(P＜0.05);给药组的早期凋亡率小于晚期凋亡率;在给药30min时，用荧光探针Fluo4-AM检测心肌细胞[Ca2+]i变化，发现诃子汤制草乌和生草乌总生物碱均可提高心肌细胞[Ca2+]i，但诃子汤制草乌总生物碱提高细胞[Ca2+]i均低于生草乌总生物碱相同剂量组。认为生草乌总生物碱改变心肌细胞[Ca2+]i是导致心肌细胞凋亡的最终可能机制。
　　 减毒机制通过研究:不同浓度的生草乌总生物碱和诃子汤制草乌总生物碱对心肌细胞的影响程度不同，通过细胞活力、细胞膜通透性变化、细胞凋亡程度和细胞[Ca2+]i的变化来评价两者对心肌细胞的毒性;研究结果发现诃子汤制草乌总生物碱通过减轻心肌细胞膜通透性及低细胞凋亡率，从而降低心肌细胞毒性。诃子汤炮制草乌对心肌细胞[Ca2+]i影响弱于生草乌，认为这是诃子汤制草乌降低心肌毒性的可能机制。通过以上对生草乌和诃子汤制草乌总生物碱的心肌细胞毒性机制及诃子汤制草乌的减毒机理的初步研究，为以后草乌对心肌毒性的研究提供可靠的实验依据。

目录

摘要

缩略词表

前言

第一章 蒙药草乌毒性研究进展

1．1 草乌在蒙医药中的应用

1．2 蒙药草乌的临床毒性表现

1．3 草乌的毒性成分

1．4 草乌的中毒机制

1．5 蒙药草乌的炮制、配伍减毒的研究概况

第二章 诃子汤制草乌及生草乌总生物碱的制备

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 乳大鼠心肌细胞的原代培养

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 PKTA与UKTA对心肌细胞的毒性研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 结果

4．4 讨论

第五章 PKTA与UKTA对心肌细胞凋亡研究

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 结果

5．4 讨论

第六章 观察PKTA和UKTA对心肌细胞内钙子浓度的影响

6．1 实验材料

6．2 实验方法

6．3 结果

6．4 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

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