酿酒酵母Bdf1p转录因子参与高盐胁迫应答的鉴定及其表型抑制基因的筛选

摘要

生物体在自然界中经常面临着剧烈的环境变化，生物体的生存依赖于对外界环境改变的及时识别以及对新环境所做出的相应反应，因此细胞发展了高度复杂的自我保护机制。目前，通过对高盐等逆境胁迫下细胞的抗逆应答分子机制的研究，不仅是功能基因组方便有效的研究模型，诠释基因的功能，同时对工业微生物的改造以及抗逆作物的培育都有重要的意义。 本实验室前期工作以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A为出发菌株，利用转座标签插入突变技术，筛选得到61株对高盐胁迫敏感的酿酒酵母突变菌株。其中突变菌株258-B10的转座标签插入点位于BDF1编码框中的1002bp处，这是首次发现Bdfl(Bromodomain transcription factor 1)转录因子可能与高盐胁迫相关。 本文拟在原有工作基础上，进一步确认转录因子与高盐胁迫敏感的相关性，我们分别构建了BDFl基因缺失菌株bdfl△和BDFl基因的表达载体pYX-PB1，梯度生长实验结果显示，bdfl△与转座标签插入突变菌株258-B10表现出相似的高盐(0.65mol/L)胁迫条件的敏感表型，而表达载体pYX-PB1转入bdfl△菌株能弥补这一缺陷表型，因此表明BDFl基因在酵母高盐胁迫中发挥重要作用。 为了进一步探寻BDFl基因与高盐胁迫的相关性，我们主要从两个方面进行研究：一方面，由于高盐胁迫对酵母细胞的毒害作用包括两方面，一方面产生Na<'+>离子毒害作用，另一方面产生渗透压胁迫，因此我们研究了Bdflp与单独的离子毒害以及渗透胁迫的相互关系，进一步确认了bdfl△对离子胁迫的敏感性。另外，ENAl基因是酿酒酵母细胞内重要的Na<'+>离子外排泵，它的调控表达受到细胞内多条重要的高盐胁迫应激信号途径，例如高渗透性促分裂源激酶途径(High osmolarity glycerol mitogen activated protein kinase signaling transduction pathway，HOG pathway)和钙调素信号途径(Calcineurin pathway)等的支配，通过研究该基因与Bdflp的遗传学关系，从而证明Bdflp并非通过调控ENA1基因来产生对高盐胁迫的应答。 另一方面，对基因功能研究的一个重要手段就是寻找该基因的交互作用或功能互补蛋白，通过分析该蛋白与功能已知蛋白相互关系，得到揭示该蛋白功能的线索。因此，我们将酿酒酵母染色体文库转化bdfl△菌株，在约20,000个转化子中，我们发现几株在高盐平板上生长表型与出发菌株相当的转化子。提取转化子中的质粒并测序，结果表明大部分质粒携带酵母染色体完整的BDF1基因，另外还有一个质粒带有BDF1基因的同源基因 BDF2。随后我们进一步研究了BDF2基因的表达剂量对bdfl△菌株的高盐敏感表型的弥补关系，分别将 BDF2基因的低拷贝与高拷贝表达载体转化bdlf△菌株，结果表明这种弥补关系并不受表达量变化的影响。同时BDF2基因的缺失并不会引起与bdfl△菌株相同的敏感表型，表明两个同源基因之间可能存在部分功能互补作用。 总之，本文采用现代分子生物学手段，开展Bdflp对高盐胁迫应答作用机制的研究，主要的目的确认Bdflp可能参与的反应传导机制；寻找可以使bdfl△菌株恢复在高盐胁迫环境下生长能力的相关基因及其蛋白因子，为更深层次解析Bdflp在高盐胁迫反应的分子机制奠定基础，进而带动对相关生命活动基础问题的认识。

目录

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摘 要

文中缩写

第一章前言

1酿酒酵母高盐胁迫应答分子机制

1.1酿酒酵母高盐胁迫应答机理

1.2离子胁迫应答功能蛋白

1.3盐胁迫下基因的瞬时应答与延迟应答机制

2酿酒酵母含有Bromodomain结构域转录因子Bdf1p功能介绍

2.1 Bromodomain结构域的功能简介

2.2 Bdf1p转录因子的功能介绍

2.3 Bdf2转录因子的功能介绍

3实验前期工作

4本论文的研究内容

第二章Bdf1p转录因子参与离子胁迫应答以及与ENA1基因遗传学关系的研究

1材料和方法

1.1菌种和质粒

1.2分子克隆用酶和试剂

1.3培养基

1.4微生物学技术

1.5分子生物学方法

1.6酿酒酵母细胞体内甘油含量的测定

2结果与讨论

2.1研究背景

2.2 BDF1基因缺失菌株的研究

2.3 BDF1基因表达载体的构建

2.4 BDF1基因与高盐胁迫关系的鉴定

2.5 BDF1基因与离子胁迫以及高渗透压胁迫关系的研究

2.6 BDF1基因与离子外排泵ENA1基因遗传学关系的研究

2.7小结

第三章BDF1缺失菌株盐敏感表型抑制基因的筛选

1材料和方法

1.1菌种和质粒

1.2分子克隆用酶和试剂

1.3培养基

1.4微生物学技术

1.5分子生物学方法

2结果与讨论

2.1酿酒酵母染色体文库功能互补生长实验

2.2酿酒酵母染色体片段的研究

2.3同源基因BDF2的研究

2.4BDF2基因低拷贝与高拷贝表达载体的构建

2.5 BDF2基因缺失菌株的研究

2.6小结

总结与展望

参考文献

在读期间发表和已被录用的论文

致谢