真菌产生的低分子抗菌肽的发酵生产、分离纯化及其性质研究

摘要

抗生素在临床治疗中的广泛使用挽救了不计其数的生命，同时，抗生素的滥用也促使抗药菌群迅猛发展，某些感染性疾病成为临床治疗的难题，能够对抗耐药菌的新型抗生素的研发迫在眉睫。本文对由山东大学微生物技术国家重点实验室筛选出来的一株产生低分子抗菌肽的青霉菌Penicillium sp.M03进行研究，在其发酵液中提取到一种具有抗菌活性的的肽类物质AF2，并对其基本性质进行了研究。 本文首先进行了预试验，证明了Penicillium sp.M03可以代谢产生抗菌肽，并且这种物质可以分泌到培养基中。为提高菌种发酵产生抗菌肽的能力，论文对真菌 Penicillium sp.M03产生抗菌肽的发酵条件进行了初步的优化，筛选了实验室条件下适宜的碳源、氮源、碳氮源之比、pH、温度、接种量和发酵时间。Penicillium sp.M03能够利用多种碳源和氮源合成抗菌肽，综合考虑多种因素，最后确定抗菌肽的最佳发酵培养基为：淀粉30g，K<,2>HPO<,4> 1g，KCl0.05g，(NH<,4>)<,2>SO<,4> 18g，MgSO<,4>·7H<,2>O0.5g，FeSO<,4> 0.01g，蒸馏水1L。种子培养基为：葡萄糖30g，K<,2>HPO<,4> 1g，KCI 0.05g，(NH<,4>)<,2>SO<,4> 18g，MgSO<,4>.7H<,2>O 0.5g，FeSO<,4> 0.01g，蒸馏水1L。最佳发酵条件为：pH 6.5，温度30℃，接种量为10﹪，摇床培养5天。 在对培养条件进行优化后，论文对青霉菌Penicillium sp.M03进行了小型发酵罐的放大试验，与摇瓶发酵相比，使用发酵罐对真菌进行发酵可以使发酵液中的抗菌肽浓度提高大约五倍，缩短发酵时间(发酵罐上的最佳发酵时间为三天)，提高一次发酵所得到的抗菌肽的量。由于真菌生长比较缓慢，因此在发酵早期容易出现感染杂菌的现象，论文在第三章的最后对发酵中出现染菌现象后的分析和解决方法进行了总结。 发酵液经过纱布过滤、离心、超滤、冷冻干燥等一系列处理得到黄色粉末，再经S印hadex LH-20，Sepharose-DEAE FF柱层析进行分离纯化，最后经过S印hadexG-15脱盐得到纯净物质，在此过程中活性峰采用平板抑菌法来确定。通过对AF2的红外光谱、核磁共振<'1>H和<,13>C光谱和质谱的解析，初步判断AF2是一种低分子多肽，分子量约为1155。AF2氨基酸组成分析结果显示其含有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等氨基酸残基。AF2的活性不受β-内酰胺酶的影响，对酸碱和蛋白酶稳定，对热也有较好的耐受性，可以有效抑制金黄色葡萄球菌、MRSA、绿脓假单孢菌等病原菌，有望开发成一种对抗耐药菌感染的新型抗菌药物。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

摘要

符号说明

第一章前言

1.1抗菌肽的来源与分布

1.2抗菌肽的分类

1.2.1 α-螺旋抗菌肽

1.2.2含半胱氨酸的抗菌肽

1.2.3富含脯氨酸和甘氨酸的抗菌肽

1.2.4β-折叠抗菌肽

1.2.5含稀有被修饰氨基酸的抗菌肽

1.3抗菌肽的性质、结构与功能

1.3.1抗菌肽的性质

1.3.2抗菌肽的结构

1.3.3抗菌肽的生物活性

1.4抗菌肽的作用机理

1.4.1锌离子盐桥的作用

1.4.2通过形成Pro铰链改变自身构型

1.4.3与膜上脂类作用

1.4.4辅助因子的共同作用

1.5抗菌肽的应用前景

1.6本课题的工作基础及可行性

第二章真菌产生抗菌培养条件的初步优化

2.1试剂及仪器

2.1.1试剂

2.1.2仪器

2.2检验Penicillium sp.M03能否产生抗菌物质的实验

2.2.1菌种及培养基

2.2.2实验方法

2.2.3实验结果

2.2.4结论

2.3真菌的发酵条件简介

2.3.1真菌的培养基

2.3.2温度

2.3.3 pH

2.3.4接种量

2.4菌种来源及培养基

2.4.1菌种

2.4.2培养基

2.5真菌产生抗菌肽发酵条件的优化

2.5.1菌种培养方法

2.5.2抗菌活性检测方法

2.5.3培养基优化方法

2.5.4发酵条件的优化

2.6发酵条件优化的结果

2.6.1培养基优化结果

2.6.2培养条件优化结果

2.7本章小结

第三章抗菌肽的发酵罐生产

3.1材料与方法

3.1.1试剂与仪器

3.1.2菌种

3.1.3培养基

3.2培养方法

3.2.1菌种活化

3.2.2种子培养

3.2.3发酵罐培养

3.3培养过程监测

3.3.1方法

3.3.2结果

3.4发酵染菌的原因分析及预防

3.4.1发酵罐染菌后的现象

3.4.2染菌原因的分析

3.4.3染菌原因的确定

3.4.4染菌问题的解决

3.4.5发酵染菌问题的预防

3.5本章小结

第四章抗菌肽的分离纯化

4.1试剂与仪器

4.1.1试剂

4.1.2仪器

4.2发酵液的前期处理

4.3检测波长的选择

4.3.1发酵液的紫外全波长扫描

4.3.2使用DAD检测器进行多波长检测

4.4发酵液柱层析分离

4.4.1 Sephadex LH-20柱层析

4.4.2 Sepharose-DEAE FF阴离子交换层析

4.4.3 Sephadex G-15脱盐

4.5分离纯化结果

4.5.1 Sephadex LH-20柱层析结果

4.5.2 Sepharose-DEAE FF阴离子交换层析结果

4.5.3 Sephadex G-15脱盐结果

4.6本章小节

第五章抗菌肽基本性质的研究

5.1试剂与仪器

5.1.1试剂

5.1.2仪器

5.2 AF2的纯度检测

5.2.1 SDS-PAGE电泳检测

5.2.2 SuperdexTM 75柱层析

5.3 AF2结构的初步探讨

5.3.1 AF2的茚三酮反应

5.3.2 AF2的双缩脲反应

5.3.3 AF2的紫外全波长扫描

5.3.4 AF2红外光谱测定

5.3.5 NMR测定

5.3.6分子量测定(ESI-MS)

5.3.7 AF2氨基酸组成分析

5.4 AF2的稳定性研究

5.4.1对β-内酰胺酶的稳定性

5.4.2对温度的稳定性

5.4.3对酸碱的稳定性

5.4.4对蛋白酶的稳定性

5.4.5 AF2抑菌作用研究

5.5结果与分析

5.5.1 AF2纯度检测结果

5.5.2 AF2结构的初步研究结果

5.5.3 AF2的稳定性实验结果

5.6本章小结

附图

总结与展望

参考文献

致谢

硕士在读期间发表的学术论文