表面活性剂对豆壳过氧化物酶活性和结构的影响

摘要

自然界中木素的降解是木质纤维素生物降解的限速步骤。降解初期产生的纤维小碎片限制了进一步和彻底的降解完全。化学上表面活性剂有优良的增溶作用。表面活性剂拥有极性头和疏水尾；而酶蛋白在不同极性溶液中表现出电解质特性，两者间有作用力。 豆壳过氧化物酶属过氧化物酶第三大家族，是一类以血红素为辅基的酶类。它来源容易、含量丰富、底物作用范围宽、耐热且在较宽的pH范围内保持稳定，呈现出优良的应用潜力。 经硫酸铵分级沉淀，CM-Sepharose离子交换柱，DEAE-Sepharose离子交换柱和Bio-Gel P-100凝胶过滤层析，得到了SBP的纯酶。SDS-PAGE凝胶电泳得到单条带。 SBP纯酶冷冻干燥；选择20mmol/L的pH2.6柠檬酸-Na<,2>HPO<,4>、50mmol/L的’pH4.2和pH5.2醋酸一醋酸钠缓冲液。实验前加适量相应缓冲液溶解使SBP浓度为250mg/ml。30℃下，设置三种表面活性剂的浓度梯度，使得每种表活剂的加入使得SBP酶活力变化，并在某一特定浓度和特定时间残留酶活力稳定。然后用选择的浓度预处理SBP 1h(选定的时间)，扫描圆二色光谱和荧光光谱；紫外一可见电子吸收光谱扫描自梯度浓度的表活剂加入后两个小时内的谱图。 实验结果表明，SBP的功能，即酶活力情况，在被三种表活剂：SDS、(AEO)<,9>、CTAB处理之后，与其结构变化之间有强烈的对应关系。强变性的阴离子表活剂SDS与带净正电荷和弱负电荷的SBP(处于pH2.6和4.2缓冲液中)有强烈的静电力作用，酶活力丧失，二级结构变化，荧光强度增加，特征Soret发生蓝移，卟啉环的π-π<'*>共轭的分裂能增大；而当SBP带净负电荷(pH5.2)时，没有静电吸引力，Soret带发生红移；SDS的引入只是限制了血红素上乙烯取代基的运动，使其与卟啉环共轭；极性环境的变化导致产生新的荧光峰：酶活力因胶团包裹作用而有下降。阳离子表活剂CTAB和非离子型表活剂(AEO)<,9>的作用结果类似：无论SBP带何种净电荷，两类物质的加入使得表观酶活力降低但不是完全失去；紫外-可见电子吸收光谱上特征Soret带位移保持不变；只是(AEO)<,9>在pH5.2缓冲液中Soret带发生红移。圆二色光谱计算所得的二级结构数据保持在误差范围内的稳定：荧光光谱显示有不强的荧光强度增加和新荧光峰位的出现：新出现的荧光峰验证了高浓度的CTAB和(AEO)<,9>形成胶团，疏水尾巴对蛋白质片基的渗透导致SBP三级结构和二级结构的解构；内源荧光氨基酸暴露，处于新的不同的极性环境。同时结构的解构引起表观酶活力的丧失。 取SBP残留酶活力失去一半时，分别比较三种缓冲液条件下三种表面活性剂处理SBP所得的荧光光谱的荧光强度和新荧光峰的出现。低浓度的SDS通过强静电吸引力使血红素对内源荧光的猝灭作用消失，荧光强度剧烈增大；而高浓度的CTAB和(AEO)<,9>形成的胶团只能较小的改变猝灭效率，跃迁能级影响不大；但是疏水尾巴的渗透使得内源荧光氨基酸暴露而引起极性环境的变化，产生明显的新的荧光峰位。

目录

文摘

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第一章绪论

第二章豆壳过氧化物酶的分离纯化

2.1材料与方法

2.1.1主要仪器与试剂

2.1.2方法

2.2结果与讨论

2.2.1豆壳过氧化物酶的分离纯化结果

2.2.2豆壳过氧化物酶的纯度鉴定

第三章SDS对SBP活性和结构的影响

3.1 SDS性质简介

3.2材料、仪器和方法

3.2.1材料和仪器：

3.2.2方法：

3.3实验结果和讨论

3.3.1不同pH下，SDS浓度对SBP活性的影响

3.3.2 SDS浓度处理SBP的圆二色光谱结果

3.3.3 SDS对SBP的荧光光谱的影响结果

3.3.4 SDS处理SBP的紫外-可见电子吸收光谱结果

3.4本章小结

第四章(AEO)9对SBP活性和结构的影响

4.1(AEO)9性质简介

4.2材料、仪器和方法

4.2.1材料和仪器：

4.2.2方法：

4.3实验结果

4.3.1不同pH下，(AEO)9浓度对SBP活性的影响

4.3.2(AEO)9对SBP的圆二色光谱的影响结果

4.3.3(AEO)9对SBP荧光光谱的影响结果

4.3.4(AEO)9处理SBP的紫外-可见吸收光谱结果

4.4本章小结

第五章CTAB对SBP活性和结构的影响

5.1 CTAB性质简介

5.2材料、仪器和方法

5.2.1材料：

5.2.2方法：

5.3结果与讨论

5.3.1不同pH下，CTAB对SBP酶活的的影响

5.3.2 CTAB浓度对SBP荧光光谱的影响结果

5.3.3 CTAB浓度对SBP紫外-可见电子吸收光谱的影响结果

5.4本章小结

第六章表面活性剂对SBP荧光光谱的作用

6.1实验结果

6.1.1 pH2.6缓冲液中三种表活剂处理后SBP失活一半时的荧光光谱

6.1.2 pH4.2缓冲液中三种表活剂处理后SBP失活一半时的荧光光谱

6.1.3 pH5.2缓冲液中三种表活剂处理后SBP失活一半时的荧光光谱

6.2讨论

全文总结

参考文献

致 谢