苯达莫司汀（Bendamustine）诱导小鼠乳腺癌细胞凋亡及其机制的研究

摘要

背景：乳腺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来呈上升趋势。在多种治疗乳腺癌的方法中，化疗仍是最为常用且效果较明显的重要手段之一。然而现有的化疗药物或多或少都会引起药物耐受性的产生，因此，寻找有效杀伤乳腺癌细胞的化疗药物已成为研究者当前的主要任务之一。临床研究表明，作为氮芥类药物且具多种功能的烷化剂，苯达莫司汀(Bendamustine)对乳腺癌有较好的疗效。然而，相关的研究数据有限，作用机制不清楚。由于很多小分子化疗药物可通过影响肿瘤细胞周期和诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长，因此本文重点研究苯达莫司汀对体外培养的小鼠乳腺癌C127细胞周期和诱导凋亡的作用及作用机制，以期为肿瘤生物学和肿瘤化疗提供理论依据。 目的：观察抗癌药物苯达莫司汀对体外培养的小鼠乳腺瘤细胞系C-127生长抑制及其作用机制，以期在细胞水平上为治疗乳腺癌提供相关的理论依据。 方法： 细胞增殖检测方法：采用形态学观察和细胞记数法检测苯达莫司汀对C127细胞形态和存活率的影响： 细胞凋亡检测方法：用吖啶橙染色法，在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化和凋亡小体；TUNEL法检测DNA的片段化； 细胞凋亡和坏死的鉴别：检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放区分坏死和凋亡； p53蛋白表达测定：免疫荧光结合激光共聚焦扫描显微技术测定细胞中p53的表达情况： 细胞周期的变化：流式细胞术检测苯达莫司汀对C127细胞周期的影响。 结果： 1．相差显微镜观察显示：苯达莫司汀20μg/ml作用C127细胞24h之后细胞形态无明显变化，48h后细胞表现出凋亡的特征，细胞突起变少，细胞中颗粒和空泡增加，细胞核明显增大。苯达莫司汀4μg/ml作用C127细胞24h，48h后细胞都表现出凋亡的特征，48h后可见少量的凋亡小体。 2.细胞计数表明：苯达莫司汀对C127的生长有明显抑制作用，并呈明显的剂量时间依赖性。 3.吖啶橙染色显示：苯达莫司汀可使C127细胞核内染色质凝集、核片段化以及出现凋亡小体。 4．TUNEL检测表明：药物处理后，C127细胞呈现DNA的片断化以及核片断化。 5.LDH活性检测显示：C127细胞采用苯达莫司汀20μg/ml处理48h后，与对照组相比培养液中LDH含量无明显差异(P>0.05)，苯达莫司汀40μg/ml处理48小时，与对照组相比培养液中LDH含量明显升高(P<0.05)。 6.免疫荧光试验表明：苯达莫司汀可使C127的p53的表达升高(P<0.05)。 7.分析细胞DNA含量发现：苯达莫司汀作用细胞24-48h后可使细胞分别阻抑在G2/M和G1/S期，并呈现时间依赖性。 结论： 1.苯达莫司汀对小鼠乳腺癌细胞的生长有明显抑制作用，并呈明显的剂量和时间依赖性。 2.不同浓度的苯达莫司汀引起细胞的死亡方式不同，低浓度以凋亡为主，高浓度则表现为坏死。 3.苯达莫司汀可能是通过是上调p53蛋白的表达来传递凋亡信号。 4.苯达莫司汀对C127细胞周期的影响与时间长短有关，作用24-48h后，使细胞周期先后阻滞在G2/M和G1/S期。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

缩略词表

第一章前言

1.1研究背景

1.1.1概述

1.1.2 bendamustine及其相关研究

1.1.3肿瘤细胞凋亡与坏死的研究

1.1.4细胞周期调控

1.1.5 p53

1.2实验目的及意义

第二章实验操作

2.1实验材料

2.1.1细胞系

2.1.2苯达莫司汀(bendamustine)

2.1.3主要试剂

2.1.4主要工作液配方

2.1.5主要仪器

2.2实验方法

2.2.1 C-127细胞复苏、培养及传代

2.2.2荧光显微镜观察细胞形态

2.2.3细胞记数

2.2.4吖啶橙染色实验

2.2.5乳酸脱氢酶测试盒检测药物的细胞毒性

2.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡实验

2.2.7免疫细胞化学实验

2.2.8流式细胞仪检测细胞周期

2.3数据统计分析

第三章实验结果及讨论

3.1实验结果

3.1.1苯达莫司汀处理C127细胞的形态学变化

3.1.2苯达莫司汀对C127细胞的体外生长抑制作用

3.1.3苯达莫司汀诱导C127细胞核片断化荧光显微镜观察结果

3.1.4苯达莫司汀对C127细胞膜完整性的影响

3.1.5苯达莫司汀处理C127细胞后DNA片断化检测

3.1.6苯达莫司汀对C127细胞p53蛋白表达的影响

3.1.7苯达莫司汀对细胞周期分布的影响

3.2讨论

3.2.1苯达莫司汀对C127增殖的影响

3.2.2苯达莫司汀可引起C127细胞死亡

3.2.3苯达莫司汀对C127周期分布及p53蛋白表达水平的影响

3.3结论

图表

参考文献

致 谢