川芎嗪二苯甲基哌嗪对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用研究

摘要

本实验采用过氧化氢作为外源性自由基生成系统，模拟血管内皮细胞的脂过氧化损伤，建立离体培养的血管内皮细胞(ECV-304)氧化应激损伤模型，观察川芎嗪二苯甲基哌嗪对氧化损伤的血管内皮细胞的保护作用及其可能的机制，其用于心、脑血管疾病治疗提供进一步的资料，同时也为传统中药的开发提供新思路。 1. 川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞活性的影响 采用MTT法测定细胞活性。实验结果显示，ECV-304细胞氧化损伤后，细胞活力显著降低(P<0.01)。经川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L处理后细胞活力明显增强(P<0.01)。 2．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞培养液LDH释放率的影响收集氧化损伤处理后的：ECV-304细胞培养上清液和细胞裂解液，参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性，计算细胞LDH释放率。实验结果表明，ECV-304细胞经H<,2>O<,2>损伤后，细胞活力降低，细胞膜通透性增加，胞内LDH漏出增多，培养液中LDH活力显著增加(P<0.01)。经川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100 μmol/L处理后，细胞LDH释放显著减少(P<0.01)。 3．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞培养液中MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力的影响收集氧化损伤处理后的ECV-304细胞培养上清液。参照MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒说明分别测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。实验结果表明，氧化损伤后胞内MDA含量显著增加(P<0.01)，SOD活力与GSH-Px活力显著降低(P<0.01)。经川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L处理后，细胞MDA含量显著减少(P<0.01)；SOD活力和GSH-Px活力均显著升高(P<0.01)。 4．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H202氧化损伤ECV-304细胞ROS的影响细胞经处理后制备细胞悬液，以：DCFH-DA负载细胞。将细胞悬液分成六组：正常组、模型组及各浓度药物作用组，依次加到96孔板中，置多功能酶标仪检测荧光值(λ<,ex>=488nm，λ<,em>=525nm)。按公式计算ROS。实验结果表明，H<,2>O<,2>氧化损伤后胞内：ROS浓度显著升高(P<0.01)，而川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L能明显降低氧化受损细胞内的ROS浓度(P<0.05)。 5．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞染色质的影响细胞经处理后，以多聚甲醛室温固定，Hoechst 33258染色并于荧光显微镜下观察并拍照。实验结果表明，细胞经Hoechst 33258染色后，正常组细胞核较大且染色均匀；模型组细胞核内可见致密的颗粒状荧光，呈现出凋亡细胞典型的核固缩、核碎裂表现；川芎嗪二苯甲基哌嗪各浓度组细胞的胞核形态趋于正常，且凋亡细胞数随剂量增加而减少。 6．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞凋亡率的影响细胞经处理后，以Annexin V-FITC/PI双染后上流式细胞仪检测。实验结果表明，与正常组比较，模型组细胞的凋亡率明显升高(P<0.01)。与模型组比较，川芎嗪二苯甲基哌嗪各浓度组细胞的凋亡率降低，且呈剂量依赖性关系，差异有显著统计学意义(P<0.01)。 7.川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞胞内钙离子浓度的影响制备细胞悬液，以Fura-2/AM负载。将细胞悬液分成六组：正常组、模型组及各浓度药物作用组依次加到96孔板中，置多功能酶标仪检测λ<,ex>=340 nm/λ<,em>=510 nm和λ<,ex>=380 nm/λ<,em>=510 nm处荧光比值。按公式计算[Ca<'2+>]<,i>。实验结果表明，ECV-304细胞氧化损伤后胞内游离钙离子浓度显著升高(P<0.01)，而川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100 μmol/L能显著抑制胞内钙浓度(P<0.01)。 8.川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞线粒体膜电位的影响细胞经处理后，经Rh123染色后上流式细胞仪检测。实验结果表明，与正常组比较，模型组细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.01)。与模型组比较，川芎嗪二苯甲基哌嗪组细胞线粒体膜电位显著升高，且呈剂量依赖性关系(P<0.01)。 9.川芎嗪二苯甲基哌嗪对H<,2>O<,2>氧化损伤ECV-304细胞胞内Bcl-2蛋白，P-53蛋白，Caspase-3蛋白表达的影响细胞经处理后，经细胞爬片、冲洗和固定，按免疫组织化学方法染色检测Bcl-2蛋白，P-53蛋白和Caspase-3蛋白表达。实验结果表明，模型组细胞Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.01)，而P-53蛋白和Caspase-3蛋白表达增加(P<0.01)。经川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100gmol/L处理后，细胞的Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)，P-53蛋白和Caspase-3蛋白表达则减少(P<0.05)。

目录

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符号说明

前言

实验材料

实验方法

1细胞培养及分组

1.1细胞培养

1.2细胞分组及处理

2实验项目及检测指标

2.1 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞活性的影响

2.2 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞产生自由基的影响

2.3 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞凋亡的影响

2.4 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞内游离钙浓度的影响

2.5 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞线粒体膜电位的影响

2.6 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞表达Bcl-2蛋白，P-53蛋白，Caspase-3蛋白的影响

3数据处理

实验结果

1 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞活性的影响

1.1 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞生存率的影响

1.2 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞LDH释放率的影响

2 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞产生自由基的影响

2.1 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影响

2.2 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞ROS荧光强度的影响

3 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞凋亡的影响

3.1 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞染色质的影响

3.2 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞凋亡率的影响

4 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞胞内钙离子浓度的影响

5 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞线粒体膜电位的影响

6 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞表达Bcl-2蛋白，P-53蛋白，Caspase-3蛋白的影响

6.1 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞表达Bcl-2蛋白的影响

6.2 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞表达P-53蛋白的影响

6.3 TMPDP对H2O2损伤ECV-304细胞表达Caspase-3蛋白的影响

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位论文期间发表的论文

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