CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的构效关系分析及其抗肿瘤作用研究

摘要

作为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence，ISS)，含有非甲基化CpG二核苷酸的寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原递呈细胞等；间接激活T细胞、NK细胞；诱导以Th1型为主的免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂。在肿瘤、免疫缺陷性疾病、感染性疾病及过敏性疾病治疗中有着强大的潜在应用价值，CpG ODN作为一种新型的免疫刺激剂越来越多地受到人们的关注。 CpG ODN的免疫刺激活性具有结构特异性，其免疫刺激活性与结构之间的相关关系仍有许多环节尚待阐明：游离的5’端结构是否免疫刺激活性所必需?回文结构的有无、多寡、碱基构成特征及其在序列中的位置对活性有无影响?此外，CpG基序在序列中的数量、距离远近、空间连接、5’端的碱基组成对ISS免疫刺激活性的影响也均有待系统研究。 CpG ODN的免疫刺激作用具有种属特异性，我们选择已知有效的小鼠特异性ISS——ODNl826为模板和阳性对照，设计了一系列不同结构的CpG ODNs，采用多种生物学方法对所设计CpG ODNs的免疫活性进行检测，并基于此进行构效关系分析，总结一些能够揭示CpG ODN免疫刺激作用机制的新规律，并对新型CpGODN的理性设计提供理论和实验依据。 研究中筛选出了若干条免疫刺激活性优于阳性对照ODN1826的ISS，对这些CpG ODN在小鼠体内的抗肿瘤活性以及对荷瘤鼠免疫调节机能的影响进行了系统的分析。此外，对CpG ODN免疫刺激活性的分子机制进行了初步研究。 一、以小鼠特异性的B型CpG ODNl826为模板和阳性对照，设计了15条CpGODNs(ODNl～ODN 5)，涉及到CpG基序在序列中的数量、距离远近、空间连接，5’端的碱基组成，回文结构的有无、回文结构碱基构成特征及其在序列中的位置等结构变化；所设计CpG ODNs作用于小鼠脾细胞，以其对细胞因子IL-6、IL-12及IFNa等分泌的影响、对B细胞增殖活性、NK细胞杀伤活性的影响等为活性指标，系统分析CpG ODNs的构效关系。结果表明：1)最佳的CpG六碱基作用基序是5’-TCGACGTT-3’，与文献报道一致；2)CpG岛缺乏两侧翼的双碱基将失去其免疫调节作用，如ODNl 5；3)CpG基序的数目最佳为2个，增加六碱基CpG基序数量(如ODN9)不增加其免疫刺激活性；4)相邻两个CpG基序之间的最适距离为3个碱基，距离的缩短(ODN5)或延长(ODN6)均会减弱CpG ODN的免疫刺激作用；5)5’端TpC二碱基对于CpG ODN的免疫刺激活性很重要，去掉5’端TpC二碱基会使免疫刺激活性明显减弱，如ODN6、ODN8；6)自身互补的回文结构对于CpG ODN的免疫刺激作用很重要，如ODN4、ODN7、ODN10和ODN11；7)回文结构在序列中的位置对活性有显著影响：3’端回文结构可增强序列的免疫刺激活性，而5’端回文结构可导致CpG ODN免疫刺激活性几乎消失，女IODN3、ODN12。值得注意的是，作为全回文结构的ODN10具有较强的免疫刺激活性，其回文结构中包含完整的CpG作用基序5’-TCGACGTT-3’，如果不包含完整的CpG作用基序，仅以重复的CpG组成的自身互补的全回文结构几乎没有免疫刺激活性，女IODNl5。 二、采用流式细胞术检测不同结构的CpG ODNsk寸特定的免疫细胞B细胞、DC细胞以及NK细胞的激活功能。将所设计CpG ODN与小鼠脾细胞共孵育，然后用流式细胞术检测DC细胞、B细胞以及NK细胞亚群表面分子表达情况，系统分析CpGODN结构与其对各种免疫细胞活化能力的关系。研究结果显示与前述构效关系分析结论一致。 三、CpG ODNs体外抗鼠源性黑色素瘤活性研究。结果表明，经CpGODN(ODN1-11)处理的小鼠脾细胞对小鼠黑色素瘤均表现不同程度的杀伤活性，不含CpG岛的ODN没有肿瘤杀伤活性；ODN4，ODN7，ODN10和IODN11的抗黑色素瘤活性明显高于阳性对照ODN1826组(P<0.05)。 四、在构效关系分析以及体外抗鼠源性黑色素瘤活性研究的基础上，选择CpGODN的有效序列(ODN1826，ODN4，ODN7，0DN10和ODN11)进行小鼠体内外抗肿瘤活性研究。研究发现，CpG ODN能不同程度延长荷黑色素瘤小鼠的生存时间，与阳性对照ODNl826比较，ODN4、ODN7和ODN11均表现出明显的肿瘤抑制作用(P<0.05)，ODNlO的作用尤为明显(P<0.01)，抑瘤率达到(55．2±2．3)﹪。肿瘤组织切片H&E染色显示，CpG ODN用药组可观察到肿瘤细胞出现核空化、核水肿以及凋亡现象，而核膜清晰可见，这种现象在肿瘤病理中较少见，其机理尚待阐明；肿瘤组织免疫组化分析显示，代表增殖活性的核抗原PCNA表达降低，表明肿瘤细胞增殖受到抑制；黑色素瘤细胞转移相关的抗原CD63表达降低，表明瘤细胞转移受到抑制。脾脏组织切片H&E染色显示，PBS组荷瘤鼠的脾脏出现大面积坏死，梗死的脾血管内可见坏死的肿瘤细胞团，而CpG ODN治疗组未见瘤细胞转移。淋巴结病理切片显示，PBS组荷瘤鼠的淋巴结中出现淋巴导管梗阻，内可见转移的瘤细胞团块，而CpG ODN治疗组未见瘤细胞转移。以上研究结果说明：CpG ODN不仅能够抑制肿瘤细胞的生长，而且能够抑制肿瘤细胞在小鼠体内的转移和浸润。 五、CpG ODN对荷瘤鼠模型体内免疫调节机能的影响。研究发现，C57 BL/6小鼠荷黑色素瘤后，血清中IL-12的含量显著降低，IgE的含量急剧上升，脾脏中B细胞、T细胞的增殖活性以及NK细胞的杀伤活性均明显下降，腹腔巨噬细胞的吞噬功能也明显减弱，提示肿瘤能够促使免疫系统Th1/Th2平衡向TH2漂移，使机体的抗肿瘤免疫效应大大减弱。而CpG ODN能诱导荷瘤鼠产生大量的IL-12，抑制IgE的产生，脾脏中B细胞、T细胞的增殖活性以及NK细胞的杀伤活性均显著增强，巨噬细胞的吞噬功能也显著增强，并且，肿瘤抑制效应越强CpG ODN所具有的免疫增强效应也越强，这两种效应呈现正相关，这强烈提示CpG ODN能够促使Th2型免疫应答向Thl型逆转，扭转因荷瘤导致的机体免疫功能低下，从而增强机体的抗肿瘤免疫效应。另外，CpG ODN各组荷瘤鼠均出现不同程度的巨脾现象，病理切片显示，脾脏红、白髓边界清晰，可见脾窦轻度充血，未见病理改变；淋巴结的病理切片显示，CpG ODN治疗组淋巴结中淋巴小结清晰可辨，淋巴细胞数量丰富，淋巴窦扩张；治疗组肿瘤组织免疫组化分析显示，肿瘤细胞表面共刺激分子CD80的表达增强，以上结果充分说明机体的抗肿瘤免疫效应增强。实验数据显示，ODN4，ODN7和ODN11的抗肿瘤免疫效应均高于阳性对照ODN1826(P<0.05)，而具有全回文结构的ODN10作用尤为明显(P<0.01)。 六、为进一步探讨CpG ODN免疫刺激活性的机理，检测了不同结构的CpGODN(ODN1826，ODNlO和ODN11)对核转录因子NF-κB、AP1的转录活性影响，同时检测了上述不同结构的CpG ODN与TLR9的结合活性。CpG ODN通过TLR9介导的多种信号转导途径来调节核转录因子的表达，如NF-κB、AP1等，从而进一步调节免疫相关的多种细胞因子的表达，最终实现CpG ODN的免疫调节功能。EMSA实验结果表明，不同结构的CpG ODN能不同程度地上调NF-κB及AP1的转录活性，ODN10能诱导NF-κB的表达，但其作用低于ODN1826或ODN10；但ODN10诱导AP1的活性高于ODN1826或ODN10，前面提到的ODN10促使IL-12的高表达可能与其对AP1的高转录活性有关。TLR9是介导CpG ODN实现免疫调节活性的重要受体，我们将ODN1826，ODN10和ODN11进行5’端生物素标记，然后分别与TLR9结合，发现三种结构的CpG ODN均能与TLR9结合，表明5’端被生物素封闭后仍然可以与TLR9结合，这与先前许多报道CpG ODN与TLR9的识别是从5’端到3’端依次进行的，CpG ODN 5’端的游离很重要的说法不一致。这提示我们，除了TLR9之外，CpG ODN可能还需要结合另一种未知的相关受体，其结合需要CpG ODN 5’端的游离。另外，EMSA实验结果显示，三种ODN分别拥有不同的空间结构：ODN1826只有一种线型结构；ODN10存在三种结构：线型、自身互补的全回文结构以及两个ODN10首尾互补的双链结构；ODN11也存在三种结构：线型、部分互补回文结构以及两个ODN11部分互补的二聚体结构。ODN10与ODN11的免疫刺激活性的多样性可能与其结构的多样性相关。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

符号说明

第一章前言

1 CpG ODN的研究进展

2.恶性肿瘤的免疫治疗进展

3.CpG ODNs在肿瘤的预防和治疗中的应用

4.CpG ODN研究现状及拟解决的问题

第二章 材料与方法

1实验材料

2主要方法

2.1 CpG ODN序列的设计合成及纯度检测

2.2 CpG ODNs刺激小鼠脾细胞增殖实验

2.3 CpG ODNs刺激小鼠脾细胞培养上清中细胞因子含量的检测

2.4 CpG ODN刺激小鼠NK细胞杀伤活性的检测

2.5流式细胞术检测CpG ODNs活化小鼠免疫细胞的能力

2 6 CpG ODNs刺激小鼠脾细胞对B16黑色素瘤细胞杀伤活性的影响

2.7 CpG ODN作用C57BL/6腹腔荷瘤小鼠存活率实验

2.8小鼠荷鼠源性B16黑色素瘤肿瘤模型的建立

2.9 CpG ODNs体内抗肿瘤药效评价

2.10 CpG ODN免疫刺激作用机理的探讨

第三章实验结果

1 CpG ODNs的设计合成与构效关系分析

1.1 CpG ODNs的设计合成

1.2 CpG ODNs的质量检定

1.3 CpG ODNs诱导小鼠脾细胞的细胞因子表达

1.4 CpG ODNs刺激小鼠B细胞增殖实验

1.5 CpG ODNs刺激小鼠NK细胞杀伤活性的检测

1.6流式细胞术检测CpG ODNs活化小鼠免疫细胞的能力

1.7 CpG ODNs的结构与其免疫刺激活性之间的关系

2 CpG ODNs小鼠体内外抗黑色素瘤活性的研究

2.1 CpG ODNs体外抗鼠源性黑色素瘤活性的检测

2.2 CpG ODN体内抗黑色素瘤活性

2.3 CpG ODN对荷瘤鼠免疫系统的影响

3 CpG ODN免疫刺激活性的机理探讨

3.1不同类型CpG ODN对核转录因子NF-κB、AP1转录活性的影响

3.2不同结构的5'端生物素标记CpG ODN与TLR9结合能力的测定

第四章讨论

1 CpG ODNs的结构与其免疫刺激活性之间的关系

2 CpG ODNs构效关系分析的验证

3 CpG ODNs体外抗鼠源性黑色素瘤活性研究

4 CpG ODN小鼠体内抗肿瘤活性研究

5 CpG ODN对荷瘤鼠模型体内免疫调节机能的影响

6 CpG ODN免疫刺激活性的机理探讨

总 结

参考文献

致 谢

附录1博士阶段发表文章

附录2已接受文章

附录3待发表文章