肿瘤相关抗原CHP2对卵巢癌细胞生物学行为的影响

摘要

[研究背景和目的]：卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，但其发病机制还不十分明确，肿瘤特异/相关抗原的鉴定、分离及其生物学功能的探讨是当前肿瘤研究的热点方向之一。CHP2(Calcineurin homologous protein 2)是最近从肝细胞性肝癌中筛选出的肿瘤相关抗原，可表达于某些肿瘤如肝癌、结肠癌、宫颈癌及白血病等组织细胞，而在相应的正常组织或细胞中没有检测到表达，其生物学功能目前尚不清楚。本研究旨在探讨CHP2在卵巢癌细胞中的表达状况及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响。 [方法]： 1、CHP2在卵巢癌组织中的表达：应用RT-PCR法测定20例正常人卵巢组织和20例卵巢上皮癌组织中CHP2 mRNA的表达。 2、质粒构建与转染：构建pEGFP-N1-CHP2表达载体，并通过脂质体介导的基因转染方法，将此质粒转染入OVCAR3细胞中，并筛选出稳定克隆。实验分为3组，CHP2基因转染组(OVCAR3/CHP2组)、空载体转染组(OVCAR3/Neo组)和空白对照组(OVCAR3组)。 3、CHP2和Na+/H+exchanger isoform 1(NHE1)在OVCAR3细胞中表达的鉴定：利用RT-PCR技术检测OVCAR3细胞中CHP2和NHE1转录水平的表达。用荧光显微镜下观察的方法检测3组细胞中CHP2绿色荧光融合蛋白水平的表达。 4、细胞增殖实验：将处于对数生长期的OVCAR3/CHP2、OVCAR3/neo和OVCAR3以相同数量接种后应用细胞活力仪每隔12小时对活细胞进行计数绘制生长曲线。 5、粘附实验：与上述相同办法分组及制备细胞，分别于15 min、30 min 60 min，或90min．用细胞活力仪分别计数上清中和贴附的细胞数，计算细胞粘附率。 6、划痕实验：将细胞以相同数量接种于预先包被有FN (Fibronectin)的6孔培养板上，单层细胞表面划出一条横行无细胞刮除带，相差显微镜下照相(10倍)并测量划痕的宽度(Oh)，36小时后，以相同的方法照相、测量。将0h划痕两端的距离设为100﹪，计算各组细胞在培养36h后的划痕区域占0h划痕区域的百分比。 7、侵袭实验：采用Transwcll小室体外侵袭实验检测CHP2基因转染前后穿透人工重组基底膜的能力。将细胞以相同数量接种于包被有Matrigel基质胶的小室上室，下室加入无血清的鼠成纤维细胞NIH3T3上清培养液。培养12 h，40倍镜下随机取10个视野计数穿膜的细胞数。 8、统计学方法：统计分析利用SPSS11.5软件包，CHP2在卵巢癌组织中的表达的统计学处理用，检验，p<0.05被认为有统计学意义。其余实验应用单因素方差分析(ANOVA)配合q检验(Newman-Keuls)进行比较，p<0.05被认为有统计学意义。 [结果] 1、CHP2：在卵巢癌组织中的表达：20例卵巢癌组织CHP2 mRNA阳性表达17例，而在20例正常卵巢组织中仅1例表达阳性。CHP2在卵巢癌组织的表达率显著增高(<'2>=25.86，p<0.05)。 2、质粒构建与转染：成功构建了CHP2基因真核表达载体并建立了稳定表达CHP2的细胞株OVCAR3/CHP2。 3、CHP2和NHEl在OVCAR3细胞中表达的鉴定：在未转染和空载体转染的OVCAR3细胞中没有检测到CHP2的表达，在pEGFP-N1-CHP2表达载体转染后OVCAR3细胞中有CHP2的高表达。在OVCAR3细胞中有NHEl的强表达，而且在转染前后没有改变。荧光显微镜下观察发现EGFP/CHP2融合蛋白主要表达于胞浆近膜区，而在空质粒转染组EGFP则广泛表达于整个细胞。 4、细胞增殖实验、粘附实验、划痕实验及侵袭实验：OVCAR3/CHP2组细胞的生长速度较OVCAR3/Neo和OVCAR3组增快(p<0.05)，粘附能力也较后两组增强(P<0.05)。OVCAR3/CHP2组细胞在划痕实验中的迁移能力和在侵袭实验中穿过人工基底膜的侵袭能力均较OVCAR3/Neo和OVCAR3组明显增强，分别具有统计学意义(p<0.05)。 [结论] 本研究证明CHP2基因表达可明显促进卵巢癌细胞生长、粘附、运动和侵袭能力。CHP2增加卵巢癌细胞恶性生物学行为的作用可能和CHP2-NHE1信号通路有关。CHP2可作为CHP2表达阳性肿瘤的生物学治疗靶点。

目录

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符号说明

前言

实验材料

实验方法与结果

一、卵巢癌及正常卵巢组织中CHP2转录水平的表达

二、真核细胞表达载体的构建

三 、CHP2在卵巢癌OVCAR3细胞中的定位

四、稳定转染细胞株的筛选、鉴定以及NHE1的表达

五、 CHP2对卵巢癌细胞OVCAR3增值能力的影响

六、 CHP2对卵巢癌细胞OVCAR3粘附能力的影响

七、 CHP2对卵巢癌细胞OVCAR3迁移能力的影响

八、 CHP2对卵巢癌细胞OVCAR3侵袭能力的影响

讨论

全文总结

文献综述CHP2和NHEs在肿瘤研究中的价值

参考文献

致谢

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