粗糙脉孢菌AS3.1602乙醇发酵的代谢研究

摘要

石油、煤炭等矿产资源是当前最主要的能源物质和化工原料。随着历史的进程，它们失去了再生的条件，大量消耗必将导致快速枯竭。以石油等不可再生资源为基础的现代工业化社会的发展模式是难以持续的。寻找可再生的替代能源和化工原料，特别是新的液态燃料，已成为维持人类社会可持续发展的紧迫任务。我国纤维素类可再生资源丰富，仅每年生成的农作物秸秆就达6亿多吨。若能采用适宜的技术将这些废物加以转化利用，不仅能够节粮、代粮，缓解能源紧缺，同时还可以保护环境，对我国经济的可持续发展将产生深远的影响。乙醇是来自可再生资源的最有发展前景的液体燃料，但目前生物法生产的乙醇主要来自糖类和淀粉，面对世界人口的急剧膨胀和粮食短缺，用粮食生产乙醇的发展将受到限制。近三十年来，在国际能源组织(International EnergyAgency)和各国政府的帮助下，各国科学家共同致力于利用植物纤维资源制取燃料乙醇的研究和开发工作，在原料预处理、菌种筛选与选育、纤维素酶制备和酶水解技术、乙醇发酵技术等方面取得了令人瞩目的进展，部分技术已进行了中试规模的研究。但由于经济和技术上的原因，目前利用植物纤维资源转化乙醇的技术仍未完善，还有待于进一步的研究。其关键难点之一在于如何进一步简化工艺路线，降低生产成本。 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) AS3.1602具有同时产生纤维素酶、半纤维素酶、发酵葡萄糖和木糖的能力，这就为我们在同一个生物反应器中，利用同一种微生物完成生物质转化为乙醇所需的酶制备、酶水解及多种糖类的乙醇发酵等全过程，从而简化工艺，降低成本，提供了可能。此方法称为微生物直接转化法或一步法(direct microbial conversion或consolidated bioprocessing)，被认为具有良好的发展前景。 本论文的主要研究目的是从纤维性物质全利用的角度出发，探讨粗糙脉孢菌一步发酵生物质生产燃料乙醇过程中，糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环机制、粗糙脉孢菌AS3.1602乙醇发酵的代谢研究细胞代谢状态、乙醇发酵的主要控制因素等，为充分而有效的利用纤维性可再生资源生产乙醇提供可靠的实验数据和理论依椐。本论文的主要研究结果如下： 一、建立了n. crassa AS3.1602胞内代谢物的抽提和检测方法采用甲醇法猝灭代谢反应并抽提胞内代谢物，分别用真空浓缩和固相萃取法对样品进行处理，并对固相萃取体系进行了优化。分别建立了有机酸和磷酸化糖的离子色谱检测方法，为Ⅳcrassa的代谢研究建立了分析基础。 二、分别对n.crassa AS3.1602的葡萄糖乙醇发酵、木糖乙醇发酵、葡萄糖和木糖混合乙醇发酵以及纤维素直接转化产乙醇的过程进行了代谢研究分析工作在三个层面上展开，具体包括胞外代谢物浓度、胞内代谢物浓度和胞内关键酶酶活的分析，并结合代谢通量分析等手段，获得了对n.crassaAS3.1602乙醇发酵代谢特征的全面认识。 1.n.crassa AS3.1602葡萄糖乙醇发酵代谢研究在本实验室前期的菌种筛选及n.crassa AS3.1602的纤维素酶生产能力研究的基础上，对n.crassa AS3.1602葡萄糖乙醇发酵的代谢特征进行了研究，通过与传统的乙醇发酵工业菌株Saccharomyces cerevisiae NAN27在胞外代谢物和胞内酶活水平上的比较，揭示了n.crassa AS3.1602在葡萄糖乙醇发酵方面存在的问题，为菌株的改造提供了前提。n.crassa AS3.1602葡萄糖乙醇发酵的主要限制因素是乙醇对发酵的抑制，当发酵液中的乙醇浓度超过2.0％(V/V)时，胞内相关酶的活性和胞内代谢物的水平就显著降低，菌丝浓度也有一定下降。 2.n.crassaAS3.1602木糖乙醇发酵代谢研究研究了氧限制对n.crassa AS3.1602木糖发酵的影响，并进行了代谢通量分析。随着氧限制程度的提高，木糖利用速率和菌体生长速率不断降低。通氧量对乙醇的产生也有显著的影响，乙醇生成的代谢流速随着氧传递速率(oxygentransfer rate，OTR)的变化不断改变。当OTR为8.4 mmol/L·h时，乙醇的产生速率和终浓度都达到最大值。绝大多数胞内代谢中间物的浓度随着氧限制程度的提高不断降低。木糖代谢的前三个酶，木糖还原酶(xylose reductase，XR)、木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase，XDH)和木酮糖激酶(xylulokinase，XK)的酶活随着氧限制程度的提高不断降低，导致木糖利用速率的降低。当OTR在0～12.6 mmol/L·h范围内变化时，转醛酶(transaldolase，TAL)和转酮酶(transketolase，TKL)酶活始终处于较低的水平，表现出对木糖代谢较强的控制作用。6-磷酸葡萄糖脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)起到主要的再生NADPH的作用，其酶活随着氧限制程度的提高不断降低。 3.n.crassa AS3.1602葡萄糖、木糖双碳源乙醇发酵代谢研究在限氧条件下进行葡萄糖、木糖双碳源混合发酵，也是在胞外代谢物、胞内代谢物和胞内酶活三个层面上进行代谢分析。研究表明，n.crassa AS3.1602在以葡萄糖和木糖为混合碳源进行发酵时，存在明显的底物利用顺序。前48 h是葡萄糖消耗阶段，之后是木糖消耗阶段。当发酵由第一阶段转入第二阶段后，木糖代谢的前三个酶的活性都大幅度提高，木糖消耗速率明显上升。为了再生足够的NADPH用于木糖的还原，代谢流由磷酸戊糖途径流入EMP途径，6-磷酸果糖浓度提高。在果糖磷酸酶的作用下，6-磷酸果糖转变为6-磷酸葡萄糖，从而进入磷酸戊糖途径的氧化分支，完成NADPH的再生。另外，添加5g/L的电子受体3-羟基丁酮可以缓解混合发酵中的木糖醇积累问题。 4.n.crassa AS3.1602纤维素乙醇发酵代谢研究对n.crassa AS3.1602好氧产酶和厌氧直接发酵纤维素产生乙醇的过程进行了代谢分析。以20 g/L的微晶纤维素为碳源进行产酶培养，好氧发酵3 d时，菌体处于稳定期，FPA酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活都处于较高水平。厌氧条件下直接转化20g/L的微晶纤维素，发酵96 h时乙醇浓度可以达到6.3g/L，仅检测到少量副产物乳酸和乙酸。胞内代谢物分析表明，在厌氧发酵阶段，随着发酵的进行，胞内6-磷酸果糖的浓度明显降低，说明该物质由磷酸戊糖途径流入EMP途径，进而转化为乙醇。发酵后期(96 h)与发酵初期(24 h)相比，胞内大多数酶的活力降低，反映出细胞活力和发酵能力的下降。 三、对n. crassa AS3.1602葡萄糖、木糖发酵的胞内代谢数据进行主成分分析利用STATISTICA 6.0软件对得到的大量胞内代谢物和胞内酶活数据进行主成分分析，确定n.crassa AS3.1602葡萄糖、木糖乙醇发酵的主要影响因素是渗透压、通氧量和底物组成，对下一步的菌株改造和发酵条件优化起到一定的指导作用。 四、利用n.crassa AS3.1602直接转化天然植物纤维物质进行乙醇发酵利用天然物质作为产酶培养基的主要碳氮源，并对其进行了优化。优化后的培养基以麸皮和玉米芯粉为碳源，以豆饼粉、硫酸铵和尿素为混合氮源。利用n.crassa AS3.1602在氧限制条件下对天然材料木糖渣进行一步转化，当发酵体积为2 L，木糖渣浓度为50g/L时，经过188 h的发酵乙醇浓度可以达到6.9g/L。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明及缩写词

声明

第一章 研究背景综述

1.1乙醇作为能源的应用现状和发展前景

1.1.1世界燃料乙醇的应用现状和发展前景

1.1.2我国燃料乙醇的应用现状和发展前景

1.2植物纤维资源发酵生产乙醇

1.2.1纤维素类资源的组成

1.2.2国内外纤维素乙醇生产应用现状

1.3植物纤维资源直接发酵生产乙醇

1.3.1生物质酶解转化工艺

1.3.2植物纤维资源直接发酵生产乙醇

1.4葡萄糖、木糖乙醇发酵

1.4.1葡萄糖乙醇发酵

1.4.2木糖乙醇发酵

1.4.3葡萄糖、木糖混合发酵

1.5代谢研究相关方法

1.5.1代谢通量分析

1.5.2胞内代谢物检测

1.5.3代谢物组学

1.5.4主成分分析

1.6 Neurospora crassa乙醇发酵方面的相关研究

1.7本论文的研究目的和主要研究内容

第二章 粗糙脉孢菌AS3.1602葡萄糖发酵代谢研究

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1菌株

2.2.2主要试剂和仪器

2.2.3培养基和培养条件

2.2.4分析方法

2.3结果与讨论

2.3.1胞内代谢物检测方法的建立

2.3.2葡萄糖初始浓度对发酵的影响(与S.ceresiviae的比较)

2.3.3乙醇对葡萄糖发酵的影响(与S.ceresiviae的比较)

2.3.4添加丙酮酸对葡萄糖发酵的影响

2.4小结

第三章 粗糙脉孢菌AS3.1602木糖发酵代谢研究

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1菌株

3.2.2主要试剂和仪器

3.2.3培养基和培养条件

3.2.4分析方法

3.2.5代谢通量分析(MFA)

3.3结果与讨论

3.3.1不同氧限制条件下的木糖发酵

3.3.2不同氧限制条件下木糖发酵的代谢通量分析

3.3.3不同氧限制条件下木糖发酵的胞内代谢物分析

3.3.4不同氧限制条件下木糖发酵的胞内酶活分析

3.4小结

第四章 粗糙脉孢菌AS3.1602葡萄糖、木糖混合发酵代谢研究

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1菌株

4.2.2主要试剂和仪器

4.2.3培养基和培养条件

4.2.4分析方法

4.3结果与讨论

4.3.1氧限制条件下N.crassa AS3.1602葡萄糖、木糖混合共发酵

4.3.2氧限制条件下葡萄糖、木糖混合发酵的胞内代谢物分析

4.3.3氧限制条件下葡萄糖、木糖混合发酵的胞内酶活分析

4.3.4不同氧限制条件下的葡萄糖、木糖混合发酵

4.3.5添加3-羟基丁酮对葡萄糖、木糖混合发酵的影响

4.3.6不同比例葡萄糖、木糖混合发酵

4.4小结

第五章 粗糙脉孢菌AS3.1602葡萄糖、木糖乙醇发酵胞内信息的主成分分析

5.1引言

5.2主成分分析(PCA)

5.3结果与讨论

5.3.1不同条件下葡萄糖发酵胞内信息的主成分分析

5.3.2 N.crassa AS.31602葡萄糖、木糖及双碳源混合发酵胞内信息的主成分分析

5.4小结

第六章 粗糙脉孢菌AS3.1602直接转化纤维素产生乙醇的代谢研究

6.1引言

6.2材料和方法

6.2.1菌株

6.2.2主要试剂和仪器

6.2.3培养基和培养条件

6.2.4分析方法

6.3结果与讨论

6.3.1好氧条件下N.crassa AS3.1602利用纤维素产酶

6.3.2厌氧条件下N.crassa AS3.1602直接转化纤维素生产乙醇

6.3.3厌氧发酵阶段胞内代谢物分析

6.3.4厌氧发酵阶段胞内酶活分析

6.3.5“一步法”发酵与同步糖化发酵的比较

6.3.6N.crassa AS3.1602直接转化天然底物生产乙醇

6.4小结

全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文

附：外文论文1

附：外文论文2

致谢