达氟沙星、培氟沙星和洛美沙星酶联免疫吸附测定法的建立

摘要

氟喹诺酮(Fluoroquinolones，FQs)是20世纪70年代后期发展起来的第三代喹诺酮类药物。作为新型合成的杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、杀菌作用强、吸收好、组织浓度高、与其他抗菌药无交叉耐药性以及毒副作用小等特点，因而广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗。但多年的研究表明，氟喹诺酮类药物在畜牧水产品中的残留有可能通过食物链危害人体健康，产生耐药性。研究开发检测药物残留的技术已受到国际社会的高度重视。 本论文采用碳二亚胺、羟基琥珀酰亚胺和混合酸酐法将半抗原达氟沙星，培氟沙星和洛美沙星偶联到由乙二胺修饰的载体蛋白牛血清蛋白和卵清蛋白上，制备免疫原和包被抗原。免疫新西兰大白兔后，获得了针对半抗原的高特异性多克隆抗体，并据此建立了氟喹诺酮类药物的酶联免疫快速检测法(ELISA)。 对于达氟沙星，ELISA测定达氟沙星抗体效价达1：256000，IC<, 50>为2PPb，检测限为0.8 PPb。交叉率测定表明，达氟沙星抗体有很高的特异性，除对氟罗沙星、培氟沙星的交叉率分别为20.6﹪、21.7﹪外，对其它氟喹诺酮类药物交叉率很低，都小于0.5﹪。实验表明达氟沙星抗体的检测范围是0.8 PPb～6 PPb。鸡肝样品中达氟沙星的终浓度为1，2，3，5 ppb时，对应的盘间平均回收率分别为105.5，84，106．7，98.8﹪，盘内平均回收率分别为109.6，78.1，100.6，97.1﹪；相应的变异系数的范围是盘问1.4～17.5﹪和盘内3.6～16.4﹪。 对于培氟沙星，ELISA测定培氟沙星抗体效价大于1：1000，000，IC<,50>为6.7 PPb，检测限为0.4 ppb。抑制实验表明，培氟沙星抗体有很高的特异性，除对氟罗沙星、氧氟沙星、恩诺沙星的交叉率为116﹪、10﹪、88﹪外，对其它氟喹诺酮类药物交叉率很低，都小于1﹪。实验表明培氟沙星抗体的线性检测范围较广，介于0.1 PPb～100 PPb之间。本研究利用该抗体建立了鸡肝样品中培氟沙星的ELISA快速检测方法。鸡肝样品中培氟沙星的终浓度为0.5，5，10，50和100 PPb时，对应的盘间平均回收率分别为96.2，103．8，94.7，92.2和94.3﹪，盘内平均回收率分别是98.4，102.6，91.5，94.6和95.2﹪；相应的变异系数的范围是盘问40.4～4.7﹪和盘内8.2～3.3﹪. 对洛美沙星，ELISA测定洛美沙星抗体效价达1：1024000，IC<,50>为0.35 ppb，检测限为0.075 PPb。抑制实验表明，洛美沙星抗体有很高的特异性，除对氟罗沙星、诺氟沙星的交叉率为8.75﹪和17.5﹪外，对其它氟喹诺酮类药物交叉率很低，都小于1﹪.实验表明其回收率范围介于0.01ppb～100 ppb之间.利用该抗体建立了牛奶中洛美沙星的ELISA快速检测方法。牛奶样品中洛美沙星的终浓度为0.1，0.2，0.3，1，2 PPb时，对应的盘问平均回收率分别是116.9，99.7，134.9，128.8，98.9﹪，盘内平均回收率分别是80.1，125.0，164.1，145.2，89.1﹪；相应的变异系数的范围是盘问9～26.91﹪和盘内4.2～26.45﹪。 酶联免疫检测法(ELISA)具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求不高，测定成本低，方法快速、简便，试剂保存时间较长，自动化程度高，无放射性同位素污染和可现场操作等优点。在药残检测过程中，ELISA是对仪器法的一种必要补充。 本研究制备了3种氟喹诺酮类抗生素与载体蛋白的偶联物，将不具有免疫原性的氟喹诺酮类小分子连接到大分子载体蛋白上形成具有免疫原性的全抗原；制备了高特异性的多克隆抗体和建立了酶联免疫检测法；并进行了实际样品体系的氟喹诺酮类药物残留的检测；实验达到较好效果，为进一步开发氟喹诺酮类抗生素的商品化的酶联免疫试剂盒，提供市场上急需的该类药物残留检测手段奠定了基础。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

摘要

符号说明

第一部分前言

1氟喹诺酮类药物简介

2氟喹诺酮类药物残留的危害

3目前检测氟喹诺酮类药物残留的方法

3.1仪器法

3.2微生物法

3.3生物免疫检测法-ELISA

3.4各种分析测试方法的比较

4酶联免疫吸附测定法(ELISA)简介

5本论文设计目的和思路

第二部分实验部分

第一章实验材料

1实验仪器

2实验试剂及实验耗材

3实验缓冲液

第二章免疫原的合成

2.1制备正电荷修饰的牛血清蛋白cBSA和卵清蛋白c0VA

2.2达氟沙星免疫原的合成

2.3培氟沙星免疫原的合成

2.4洛美沙星免疫原的合成

第三章抗体的制备

3.1达氟沙星、培氟沙星抗体的制备

3.2洛美沙星抗体的制备

3.3抗体纯化

第四章抗体检测

4.1ELISA最佳测试条件

4.2抗体的效价测定

4.3抗体的特异性测定

4.4抗体交叉率的测定

4.5回收率测定

第三部分结果与讨论

第一章免疫原的合成与鉴定

1.1载体蛋白的选择

1.2达氟沙星免疫原的合成与鉴定

1.3培氟沙星免疫原的合成与鉴定

1.4洛美沙星免疫原的合成与鉴定

第二章抗体制备的讨论

2.1多克隆抗体的概念

2.2免疫动物

2.3佐剂的应用

2.4采血方法

2.5器械灭菌

2.6饱和硫酸铵纯化

2.7抗血清的冻存

2.8免疫方法的比较

第三章抗体的检测

3.1影响ELISA检测的因素

3.2抗体最佳检测条件、抗体效价及特异性测定

3.3抗体的交叉率测定

3.4回收率的测定

第四章结论

4.1达氟沙星抗体小节

4.2培氟沙星的小节

4.3洛美沙星的小节

4.4全文总结

参考文献

致谢

硕士期间发表文章