人IL-15基因修饰NKL细胞系的生物学特性研究

摘要

目的: NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。其杀伤功能的出现不需要预先刺激或致敏，无MHC(组织相容性复合物)限制性。NK细胞不仅能够介导对肿瘤细胞的天然杀伤作用，还能够调节特异性和非特异性免疫应答。过继转输活化的或同种异体的NK细胞，已经应用于白血病和某些实体肿瘤的治疗中。 白细胞介素-15(IL-15)由多种组织和细胞亚群产生，与IL-2在功能上有许多相似之处，可以诱导CD34+的细胞分化为NK细胞，并且能够促进NK细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性。我们已经建立了IL-15基因修饰的NK-92细胞系，证实IL-15的基因修饰能够增强NK-92细胞对多种肿瘤的杀伤能力。 与NK-92细胞相比，NKL细胞有着不同的杀伤谱，比如，NKL对于人胃癌细胞系SGC7901的杀伤能力强于NK-92细胞，因此可以作为NK-92的重要补充。NKL细胞系由Robertson等建立，来源于CD3-CD16+CD56+的大颗粒淋巴细胞自血病患者的外周血。NKL依赖于IL-2生长，具自然杀伤活性和ADCC效应，其增殖反应也与正常的CD16+CD56dim NK细胞相似。NKL是NK细胞系中与原始NK细胞最为相近的，因此成为过继免疫治疗的又一重要选择。 本文建立了稳定转染hIL-15的NKL细胞系，证明IL-15基因修饰的NKL细胞具有更强的增殖、抗凋亡和对肝癌 细胞的杀伤作用，并初步探讨了其分子机制。 方法 1.电转将IL-15基因稳定转染入NKL细胞系。 2.CTLL-2增殖分析测定细胞培养上清中IL-15的生物学活性。 3.酶联免疫吸附分析测定细胞培养上清中IL-15的浓度。 4.RT-PCR检测三种NKL细胞中凋亡相关基因和杀伤相关基因的表达水平。 5.CCK方法用于分析三种NKL细胞在不同浓度IL-2和IL-15条件下的增殖水平。 6.流式细胞术检测三种NKL细胞凋亡、周期以及膜表面NKG2D和NKG2A分子的表达。 7.MTT方法检测三种NKL细胞的细胞毒作用。 结论: NK细胞作为固有免疫的重要组成部分，是抵御病毒感染和肿瘤细胞的第一道防线，由于无需抗原预先作用，就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此，在肿瘤免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。应用NK细胞系成为肿瘤生物治疗的重要手段，其中NK-92细胞已经进入期临床试验。为了克服NK细胞系在应用中的某些不足，基因修饰已经成为增强NK细胞杀伤活性的主要手段。迄今为止，已有IL-2，IL-15，SCF，CD20等多种基因用于修饰NK-92细胞，取得重要进展。 为了获得临床应用的NK细胞株，我们成功建立了IL-15基因修饰的NKL细胞株，IL-15基因修饰的NKL细胞株在低剂量IL-2和IL-15条件下表现出更强的增殖能力，并且在无血清饥饿状态下表现出较强的抗凋亡作用。进一步研究表明，在IL-15基因修饰的NKL细胞中，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x1、Mcl-1表达水平显著升高，凋亡基因Bim、Noxa、Fas的表达水平则降低。更为重要的是NKL-IL-15细胞不仅在体外能够有效杀伤肝癌细胞HepG2、H7402、PLC/PRF-5，亦能显著增强体内对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用。这种抗肿瘤效应与NKL-IL-15细胞IFN-γ、FasL和Perforin基因的表达水平提高相关。因此，人IL-15基因修饰的NKL细胞的生物学特征更有利于临床过继免疫治疗的应用。

目录

论文说明：主要符号说明

声明

摘要

文献综述

一、NK细胞的生物学功能

二、NK细胞系的建立及其在过继免疫治疗中的应用

三、IL-15在NK细胞发育分化中的重要作用

四、基因修饰NK细胞系的建立

参考文献

1前言

2材料和方法

2.1主要实验材料

2.2主要仪器设备

3主要实验方法

4实验结果

4.1人IL-15基因修饰的NKL细胞系的建立

4.2 IL-15基因修饰对NKL细胞系增殖、凋亡和细胞周期的影响

4.3 IL-15基因修饰对NKL细胞系体外杀伤活性的影响

4.4 IL-15基因修饰的NKL细胞对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用

5讨论

附录

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢