CD70在肝癌中的表达及其对淋巴细胞增殖抑制作用的研究

摘要

目的： 探讨CD70基因在肝癌中的表达，并对其在肝癌免疫逃逸中的作用进行初步探讨，为阐明肝癌的免疫逃逸机制奠定基础，为寻找肝癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。 研究方法： 一.CD70在肝癌中的表达及其克隆表达　　1.RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达设计合成针对CD70基因的特异性引物，收集肝癌组织、癌旁组织和肝癌细胞系BEL-7402、HepG2、SMMC-7721细胞，利用Trizol试剂抽提细胞总RNA，经RT-PCR检测CD70 mRNA的表达。 2.真核表达载体PcDNA3-CD70的构建设计合成针对CD70基因编码区的PCR引物序列：上游引物包含HindIII酶切位点，下游引物包含BamHI酶切位点，以BEL-7402cDNA为模板，PCR扩增人CD70基因。PCR产物经HindIII、 BamHI双酶切，回收后克隆入PcDNA3.0载体。连接产物转化大肠杆菌JM109，LA平板筛选阳性重组子，并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。 3.高表达真核表达载体PRK-CD70的构建设计合成针对CD70基因编码区的PCR引物序列：上游引物包含NotI酶切位点，下游引物包含SalI酶切位点，以BEL-7402cDNA为模板，PCR扩增人CD70基因。PCR产物经NotI、SalI双酶切，回收后克隆入PRK载体。连接产物转化大肠杆菌JM109，LA平板筛选阳性重组子，并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。 4.RT-PCR和Western blot方法检测CD70蛋白表达水平PcDNA3-CD70、PRK-CD70分别转染肝癌细胞系HepG2，24h后利用Trizol试剂抽提细胞总RNA，经PT-PCR检测CD70mRNA的表达，提取总蛋白，Western blot分析CD70蛋白表达情况。　　 二.CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究　　 1.CCK8方法检测CD70对活化Jurkat增殖的影响将真核表达质粒pcDNA3-CD70、PRK-CD70转染肝癌细胞系HepG2(同时设空载体和空细胞对照)，转染24h后，与活化Jurkat共培养24h后，加入CCK8试剂，置37℃、5％CO2孵箱显色1.5h后，酶标仪上测450nm OD值，计算Jurkat增殖抑制率。 2.RT-PCR检测Jurkat细胞活化前后CD27、Siva的表达情况设计合成针对CD27、Siva基因的特异性引物，分别收集活化前后Jurkat细胞总RNA，经RT-PCR检测CD27、Siva的表达情况。 结果： 一. CD70在肝癌中的表达及其克隆表达　 1.RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达10例肝癌组织中3例CD70基因表达呈阳性，2例癌旁组织CD70基因表达均呈阴性。肝癌细胞系Bel-7402，SMMC-7721中CD70基因表达呈阳性，HepG2细胞中CD70基因表达呈阴性。 2.成功构建真核表达载体PcDNA3-CD70阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定，证明重组载体PcDNA3-CD70构建成功。 3.高表达真核表达载体PRK-CD70的构建阳性重组子质粒抽提后分别进行连接后单、双酶切、PCR、DNA测序分析鉴定，证明重组载体PcDNA3-CD70构建成功。 4.RT-PCR和Western blot方法检测CD70蛋白表达水平重组子(PcDNA3-CD70、PRK-CD70)DNA转染HepG2细胞后，RT-PCR和Western blot分别检测到CD70在RNA和蛋白质水平上有表达，并且高表达载体(PRK-CD70)的表达率较PcDNA3-CD70明显升高。 二.CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究　　1.肝癌细胞系中CD70可显著抑制活化Jurkat细胞的增殖CCK8结果显示，转染CD70后的HepG2与Jurkat共培养后，Jurkat增殖抑制率与空细胞对照组和空载体对照组相比显著升高。 2.Jurkat细胞活化后CD27、Siva的mRNA表达水平明显升高RT-PCR结果显示，活化后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA水平较活化前明显升高。 结论及意义： 本研究首次采用PT-PCR检测了肝癌细胞系和肝癌标本中CD70的表达情况。结果显示肝癌细胞系BEL-7402，SMMC-7721中CD70表达呈阳性，HepG2细胞中CD70表达呈阴性。10例肝癌组织中3例CD70表达呈阳性，2例癌旁组织CD70表达均呈阴性。 本研究首次构建了CD70真核表达载体(PcDNA3-CD70)，并构建了表达率较高的高表达真核表达载体(PRK-CD70)，并检测到其在RNA和蛋白水平均有表达。转染肝癌细胞系HepG2细胞，通过比较转染前后的肝癌细胞对活化的Jurkat细胞增殖的影响，发现转染CD70基因后的肝癌细胞明显抑制了Jurkat细胞的增殖。 有研究指出CD70-CD27可引起活化淋巴细胞的凋亡。CD27和fas一样同属于肿瘤坏死因子受体超家族的成员，但CD27与fas受体不同，CD27的胞浆尾区缺乏胞浆死亡结构域。CD70转导凋亡信号需要借助一种凋亡前体蛋白，Siva。Siva蛋白含有一个类似胞浆死亡结构域的区域，与CD27的胞浆尾区结合传导凋亡信号。本研究采用PHA刺激Jurkat细胞使其活化，分别检测刺激前后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA表达，发现刺激后Jurkat细胞CD27、Siva的mRNA表达水平明显升高。由此可见，被CD70基因抑制的Jurkat细胞可能会有凋亡发生，但这还有待进一步证实。 本研究首次提出了CD70在人肝癌中的免疫抑制作用，为进一步阐明肝癌的免疫逃逸机制奠定了基础，为寻找肝癌免疫治疗的新靶点提供理论依据。

目录

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前言

第一部CD70在肝癌中的表达及其克隆表达

1材料

1.1质粒与菌种

1.2细胞株

1.3主要试剂

1.4试剂盒

1.5 DNA分子量

1.6 PCR引物设计与合成

1.7其他试剂

1.8主要实验仪器

2方法

2.1 RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达

2.2重组质粒的构建及鉴定

2.3真核表达载体PPK-CD70和pcDNA3.0-CD70的体外表达研究

3结果

3.1RT-PCR检测CD70的在肝癌标本和肝癌细胞系中的表达

3.2重组质粒的构建及鉴定

3.3真核表达载体体外表达研究

4讨论

第二部分CD70蛋白在肝癌细胞系中对活化淋巴细胞的增殖抑制作用研究

1材料

1.1细胞株

1.2主要试剂

1.3 PCR引物设计与合成

1.4主要实验仪器

2方法

2.1脂质体介导的CD70基因的转染

2.2 CCK8方法检测CD70基因对活化Jurkat增殖的影响

2.3 RT-PCR检测活化前后Jurkat CD27,Siva的表达情况

3结果

3.1 CD70在肝癌细胞中的表达对活化Jurkat细胞增殖的影响:

3.2 RT-PCR检测活化前后Jurkat CD27,Siva的表达情况

讨论

小结

附图

第一部分附图

第二部分附图

附录质粒物理图谱

参考文献

致谢

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