维生素K2对人肝细胞肝癌表达脱-γ-羧基凝血酶原（Des-γ-carboxy-prothrombin，DCP）抑制作用观察

摘要

目的：脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)是肝细胞肝癌产生的异常凝血酶原，其机制可能与肝癌细胞缺乏或对维生素K利用障碍，造成依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶活性降低，导致内质网产生的凝血酶原N端10个谷氨酸残基羧化不全致DCP大量产生并分泌至血液中。我们认为，DCP不但可以作为肝细胞癌(HCC)诊断的标志物，更重要的作用在于其可能具有刺激肝癌细胞增殖作用。所以，抑制肝癌细胞DCP的产生和降低血液中含量，可能达到抑制DCP对肝癌细胞的进一步刺激增殖作用，达到辅助治疗肝癌的目的。维生素K类药物及其衍生物被发现可能具有一定的抑制肝癌细胞产生DCP作用，降低血液DCP水平，有效抑制肝癌细胞生长，改善临床症状，作用机制可能与其促进肝癌细胞γ谷氨酰羧化酶活性有关。本研究通过实验观察了维生素K2对肝细胞肝癌的抑制作用，证实了其与降低DCP表达之间的相关性。 方法：体外实验，以MTT法检测了VitK2对人肝癌细胞(HCC)生长抑制作用，以集落形成法测定VitK2对长时间接触肿瘤细胞克隆原细胞的抑制活性。以Transwell小室模型方法观察了VitK2对HCC细胞体外侵袭能力的抑制作用。体内实验，以裸鼠接种人肝癌细胞，灌胃给予VitK2，观察其对HCC细胞的生长抑制作用。DCP表达水平检测方法，以ELISA法检测体外培养细胞上清液和动物血液DCP水平；以Westernblot和免疫组织化学法分析HCC细胞DCP表达状态。 结果：体外结果显示，不同剂量VitK2与HCC细胞孵育不同时间，VitK2对HCC增殖具有一定的生长抑制作用，并呈现剂量和接触时间依赖性关系。VitK2具有明显抑制HCC细胞侵袭和穿过Matrigel的能力，其对肿瘤细胞的抑制增殖作用在裸鼠移植HCC细胞实验中得到证实。在研究VitK2抑制HCC细胞增殖与DCP表达水平相关性方面，VitK2(2-40μM)明显降低HCC细胞培养上清液中。DCP表达水平，对HCC生长抑制作用和DCP水平下降呈现相关性，这种作用在裸鼠移植人肝癌细胞表达DCP及VitK2治疗实验中得到证实。 结论：VitK2具有抑制人肝癌细胞增殖的作用，其机制与降低细胞表达DCP水平有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

实验部分

主要实验材料

实验方法

1.细胞培养

2.药物配制

3.药物对细胞生长的影响

4.集落形成法测定VitK2对肿瘤克隆原细胞抑制实验方法

5.Transwell小室模型测定细胞体外侵袭能力

6.DCP水平测定

7.体内实验方法

8.统计学分析

实验结果

1.VitK2对HCC细胞生长抑制作用

2.VitK2对人肝肝癌克隆原细胞抑制作用

3.VitK2抑制PLC/PRF/5细胞侵袭作用

4.对人肝细胞癌裸鼠移植瘤抑制作用

5.VitK2抑制HCC细胞DCP表达作用

5.1 ELISA法测定结果

5.2 Western blot实验结果

5.3免疫组化法观察VitK2的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文