再生障碍性贫血患者体外共刺激信号阻断作用的研究及染色体分析

摘要

第一部分CTLA-4Ig及抗CD40L单抗对再生障碍性贫血患者体外骨髓T细胞活化及单个核细胞细胞因子诱生水平影响的研究 AA的确切发病机制至今仍未完全阐明。长期以来，造血干细胞异常、造血微环境异常以及细胞免疫功能紊乱被认为是再障的三个主要发病机制。其中免疫抑制治疗对多数再障患者有确切疗效使人们倾向于接受再障是针对造血干细胞的一种自身免疫性疾病这一观点。再障研究发现的诸多细胞免疫异常如T细胞亚群的变化（包括CD4/CD8比值降低，Th1/Th2漂移等）以及细胞免疫相关细胞因子的变化等也为这一学说提供了越来越多的证据。 抗原特异性的T细胞活化过程中需要抗原信号和共刺激信号分子的双重作用，阻断共刺激信号可诱导抗原特异性的T细胞免疫无能。共刺激阻断剂用于移植耐受、自身免疫性疾病等的治疗，在体内、外试验中已经取得比较肯定的疗效。 我们在前期关于再障T细胞早期激活及共刺激信号分子检测等研究的基础上，进一步研究用共刺激信号相关分子CTLA-4Ig、抗CD40LmAb诱导再障患者骨髓T细胞免疫无能，一方面加深对再障免疫发病机制的认识；另一方面，为探讨上述分子作为免疫调节剂治疗再障的潜能提供实验室研究资料。主要内容包括运用流式细胞分析及ELISA方法，研究CTLA-4Ig/抗CD40LmAb对骨髓T细胞体外增殖、活化及骨髓单个核细胞体外诱生细胞因子水平的影响。 目的：CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb分别与B7和CD40L结合，抑制T细胞发挥效应所必需的共刺激信号的作用，从而诱导T细胞无能。细胞免疫异常是再障患者免疫发病机制的主要方面，因此我们通过流式细胞术方法及ELISA方法，测定CTLA-4Ig/抗-CD40LmAb作用前后再障患者骨髓T细胞表型的变化及单个核细胞体外诱生细胞因子水平的变化，从而初步判断共刺激信号阻断对纠正再障异常细胞免疫的可能作用。 材料和方法： 1.再障患者48例，其中重型再障（SAA）20例，非重型再障（NSAA）28例。正常对照16例。 2.无菌抽取患者髂后上棘骨髓8-10ml或胸骨骨髓约5ml，抽取正常对照骨髓5ml，肝素抗凝。 3.密度-梯度法分离骨髓单个核细胞（BMMNCs）。 4.骨髓单个核细胞体外培养： 1）再障患者BMMNCs分为3份：CTLA-4Ig组、抗-CD40LmAb（4F1）组、再障对照组，体外培养5d后，再加入PHA（20μg/ml），培养2d。 2）正常对照组BMMNCs体外培养5d后，再加入PHA（20μg/ml），培养2d。 3）收集细胞 4）离心取上清，过滤分装，-20℃保存待检测。 5.ELISA方法检测再障三组及正常对照组细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10诱生水平 6.流式细胞术分析上述再障三组CD4+/CD8+/CD3+、CD25+、CD4+CD25+和CD8+CD25+表型细胞的变化。 7.统计学处理 结果： 1.SAA及NSAA患者骨髓MNC诱生IL-2、IFN-γ水平较正常对照组显著增高（P<0.05），IL-10水平均较正常对照显著降低（P<0.05） 2.SAA较NSAA患者骨髓MNC诱生IL-2、IFN-γ水平显著增高（P<0.05）；但二者诱生IL-10水平无显著性差异（P>0.05）。 3.CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb均可降低SAA、NSAA患者骨髓MNC培养上清诱生IL-2、IFN-γ水平水平（P<0.05），但较正常对照组仍显著性增高（P<0.05）； 4. CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb均可增高SAA、NSAA患者骨髓MNC培养上清诱生IL-10水平（P<0.05），但较正常对照组仍有显著性差异（P<0.05）； 5. CTLA-4Ig和抗-CD40LmAb（4F1）均能够降低再障（包括重型和非重型）骨髓淋巴细胞群体中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+、CD4+CD25+、CD8+CD25+细胞的比值，（P<0.05）。 结论： 1.CTLA-4Ig及抗-CD40LmAb（4F1）均能够降低再障患者体外BMMNC诱生IL-2、IFN-γ水平，提高IL-10诱生水平。 2.CTLA-4Ig及抗-CD40LmAb（4F1）能够降低骨髓淋巴细胞群体中T淋巴细胞的比值，抑制再障患者骨髓T淋巴细胞的异常活化。 3.CTLA-4Ig及抗-CD40LmAb（4F1）能够降低T淋巴细胞活化标志CD25的表达，且CD4+、CD8+群体中CD25的表达均降低。 第二部分再生障碍性贫血患者的细胞遗传学研究 长期以来，造血干细胞异常、造血微环境异常以及免疫功能紊乱被认为是再障的三个主要发病机制。在细胞遗传学和分子生物学技术时代之前，血液学界传统上以及普遍接受的观念认为，再障不是一种克隆性疾病。再障患者恶性肿瘤发病率不高也支持这一观念。然而，近年来不少实验研究结果对“再障不是克隆性疾病”的传统观念提出了挑战，认为异常的造血克隆可能并非继发发生，而是患者本身所固有的，只有当机体免疫受抑后，异常的造血克隆便得以扩展开来。 目的：再障是否是克隆性疾病这一争论事关再障的疾病本质，且对今后再障的研究方向和诊治策略均将产生重要影响。故本实验应用R显带技术进行染色体核型分析，以期验证再障患者是否存在异常核型。 材料和方法： 1.再障患者25例，其中重型再障（SAA）10例，非重型再障（NSAA）15例。正常对照20例。 2.无菌抽取患者髂后上棘骨髓或胸骨骨髓约5ml，抽取正常对照骨髓2ml，肝素抗凝。 3.直接法（D） 3.1.用0.2％肝素湿润之针筒抽取骨髓，根据细胞计数，将骨髓（约为培养法细胞数的3～4倍）加入20ml血清瓶中，加生理盐水至20ml； 3.2加入秋水仙胺37℃温箱，1小时； 3.3离心，弃上清液； 3.4低渗：加入预温的贮存液，轻轻打匀，置37℃30分钟： 3.5固定：加入固定液固定，离心，配成细胞悬液，置4℃保存； 3.6气干法制片后，Giemsa染液染色，水洗，晾干后显微镜检。 4.培养法（C24） 4.1用0.2％肝素湿润之针筒抽取骨髓，注入取样瓶，在超净台内抽取标本计数有核细胞，无菌接种1640培养基内。37℃恒温箱放置24小时； 4.2-4.6同直接法。 5.显微镜检 结果：25例再障患者和20例正常对照均未发现异常核型 结论：再障患者尚未发现异常核型，但样本数量有待进一步扩大及随访分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

研究背景　T细胞共刺激信号在再生障碍性贫血的发病及治疗中的研究和前景

一、T细胞共刺激信号在再生障碍性贫血的发病中的研究

二、共刺激信号在再生障碍性贫血的治疗中的研究

参考文献

第一部分CTLA-4Ig及抗CD40L单抗对再生障碍性贫血患者体外骨髓T细胞活化及单个核细胞细胞因子诱生水平影响的研究

前 言

病例和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

负性共刺激信号通路在再障治疗中的临床应用前景

第二部分 再生障碍性贫血患者的细胞遗传学研究

前 言

病例和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

致 谢

攻读研究生期间发表的文章

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