吸烟与程序性细胞死亡因子4(PDCD4)及原发性肝癌相关性的研究

摘要

研究背景与目的：原发性肝癌是世界上流行最高的十种恶性肿瘤之一，流行病学资料已证实肝癌的发生是多因素协同作用的结果。在我国肝癌的发生主要与HBV、HCV感染、黄曲霉毒素（AFB1）摄入以及饮水污染等有关，而且具有较明显的家庭易感性。其中环境因素较遗传因素更为重要。日本还发现饮酒和吸烟均为HCC的危险因素，且二者可协同作用。意大利的HCC病例中，大量饮酒占45％，HCV占30％，HBV占22％。每年约发病62万例，其中42.5％发生在中国，并有上升趋势。而在这些患者疾病的进程当中，通常都有氧化应激的持续存在。 程序性细胞死亡因子4（PDCD4）最早是作为在细胞凋亡早期上调的基因之一被发现的，近期的许多研究显示它还是肿瘤的抑制基因。PDCD4被发现在能抵抗恶性转化诱导的JB6 P-细胞中高表达，而在对于恶性转化敏感的P+细胞中则恰恰相反，并且，通过转染反义的PDCD4序列使PDCD4表达降低，结果导致细胞对于肿瘤诱导物敏感而发生恶性转化，这一现象已经在体内试验中被证实。尽管目前已经有许多作用于转录阶段的肿瘤抑制物被发现，PDCD4是目前为止第一个被发现作用于蛋白翻译阶段的肿瘤抑制物。它通过与真核细胞翻译起始因子eIF4A，eIF4G相作用，以一种mRNA特异性的方式来抑制翻译，并影响了肿瘤发生阶段的一些重要事件，比如AP-1依赖性的转录的激活非贴壁依赖性的生长和侵袭性的增加。肿瘤抑制物的失活对于肿瘤的发生具有很大作用，尽管许多肿瘤抑制物，例如p53，都是通过突变的方式来失活的，其他的一些比如PDCD4却不是通过这种方式来失活的。已经有研究发现，在一系列的肿瘤中，例如肺癌，结肠癌中，PDCD4的表达随着肿瘤的进展而下调，同时有研究发现Akt，p70s6k可以在肿瘤诱导物TPA作用下和血清剥夺的情况下被激活，接着使PDCD4发生磷酸化而降解，并且ERK通路在TPA诱导的PDCD4下调这一过程当中起着关键的作用。 吸烟（cigarette smoking，CS）是某些肿瘤进展的危险因素这一观点现在已经被广泛接受了，但是它导致癌症的具体机制仍无明确定论，特别是香烟组分当中的水溶性部分的作用。过去有研究发现香烟提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以在其作用的细胞中引起特异性的应激反应，比如产生氧化应激，DNA条带的断裂，应激反应基因的表达等等。除此之外，吸烟也可以产生炎症激活作用，例如它可以促进白介素IL-8从支气管上皮细胞释放等。就我们所知，目前关于吸烟的危害主要集中在吸烟对肺癌的诱发作用及对肺部疾病和心血管疾病的作用的研究，虽然曾有普查性的研究显示吸烟会使肝癌的发病率增高，但目前很少有关于吸烟对于肝癌细胞的作用机制的研究。在这里我们是想通过这项试验来观察吸烟对于肝细胞中PDCD4基因的表达是否有影响，以及探索可能的影响机制。 方法： 1.临床病例分析：观察原发性肝细胞肝癌患者中吸烟以及PDCD4表达情况的关系。由于影响肝细胞肝癌发病的因素很复杂，为了去除比较极端的因素，本研究制定了入选标准：1）男性；2）年龄>30岁：3）HBsAg阳性；4）术前通过影像学检查除外肺转移及其他肝外转移；5）经历肝细胞肝癌手术切除治疗，术中确定剩余肝脏无肿瘤残余；6）术后病理证实为肝细胞肝癌，且标本切缘无肿瘤残余。严格准入条件以尽量减少可能的干扰因素。收集患者手术切除的肿瘤组织标本及癌旁无肿瘤细胞的正常组织标本，应用免疫组织化学法和western blotting法检测肿瘤组织中及癌旁正常组织中PDCD4的表达情况。通过问诊确定患者吸烟情况，明确患者每天吸烟平均支数，以及吸烟总年数，换算成每年吸烟的包数（按照每包20支烟计算），同时综合考虑患者病情确诊时的年龄，手术中发现的肿瘤的大小，数目，门静脉及肝静脉侵袭情况，肝内胆管侵袭情况，肝脏总体情况，以及肿瘤组织的分化情况。组织在数据搜集后被编码，然后通过SPSS11.5统计学软件对结果进行曼-惠特尼U检验和菲希尔精确度检验，并以P<0.05确认存在显著性差异。 2.培养正常人类肝细胞L02，肝癌细胞HepG2，应用针对人PDCD4的特异性抗体，通过western blot法及免疫细胞化学法检测在这二种细胞中PDCD4的表达情况的区别。根据以往研究提供的方法制备香烟提取物，简单来说，就是将两支不带过滤装置的香烟连接一个改良过的注射器，使燃烧产生的烟雾通过50ml不含血清的DMEM培养液，通过测定pH值来确定终止点，在pH值达到7.4的时候终止。然后通过孔径0.20μm滤膜除去细菌和杂质。应用5％浓度的CSE作用于人肝细胞L02不同时间，四氮唑蓝法（MTT）检测细胞活性增殖性改变情况，RT-PCR检测PDCD4基因改变情况。然后分别应用不同浓度（1％，5％，10％）的CSE作用于L02细胞4个小时，并应用5％ CSE分别刺激L02细胞不同时间（1h，4h，16h，24h），通过western blot法检测观察PDCD4蛋白水平改变情况。通过使用新蛋白翻译抑制剂放线菌酮，结合应用5％ CSE刺激L02细胞4小时，观察CSE对PDCD4蛋白的作用是发生在翻译阶段还是翻译后阶段。分别应用相关通路特异性阻断剂：PKC阻断剂Ro31-8425，MEK-ERK阻断剂PD98059，PI3K阻断剂LY294002，p38MAPK阻断剂SB203580，JNK阻断剂SP600125预处理细胞，然后应用5％ CSE刺激L02细胞4小时，收集细胞提取蛋白通过western blot测定PDCD4蛋白含量改变情况，以观察上述通路在CSE对PDCD4作用过程中起的作用。 结果： 1.临床病例分析结果发现，在分析的68名男性并且不伴转移的原发性肝细胞肝癌患者中，吸烟组和不吸烟组的肿瘤组织中PDCD4表达无明显差异（P>0.05）。但是在癌旁正常组织的比较中，吸烟组PDCD4的表达明显低于不吸烟组（P<0.05）分别对吸烟组和不吸烟组的肿瘤组织和癌旁组织中PDCD4含量进行比较，发现在这两组中，肿瘤组织中PDCD4的含量较之癌旁正常组织中的均有所降低，不吸烟组的肿瘤组织和癌旁组织中PDCD4的差别更加显著（P<0.01）对于其他相关因素比较，我们发现吸烟组的平均发病年龄比不吸烟组低，而不吸烟组患者的肝脏一般情况较差，二组在肝内门静脉，肝静脉及肝内胆管的侵及程度上没有显著性差异。 2.通过对正常肝细胞L02及肝癌细胞HepG2中PDCD4含量的比较，我们发现肝癌细胞中PDCD4蛋白含量较正常肝细胞减少，这一区别具有显著性差异（P<0.05）。应用5％浓度的CSE作用于人肝细胞L02不同时间，MTT检测结果发现对细胞活性并无明显影响，RT-PCR结果显示PDCD4的mRNA的表达在CSE刺激下并无明显改变。通过不同浓度CSE的刺激和同一浓度不同时间的刺激，我们发现CSE刺激可以减少PDCD4蛋白水平，并且这一作用呈现一定的剂量和时间依赖性。通过结合应用新蛋白翻译抑制剂放线菌酮和5％浓度的CSE，我们发现同时应用这两者的情况下PDCD4蛋白水平随时间变化减少的更加迅速（P<0.05），这说明CSE对PDCD4的作用可能是发生在翻译后。通过应用特异性通路阻断剂：PKC阻断剂Ro31-8425，MEK-ERK阻断剂PD98059，PI3K阻断剂LY294002，p38 MAPK阻断剂SB203580，JNK阻断剂SP600125预处理细胞，然后应用5％ CSE刺激L02细胞4小时，通过western blot检测PDCD4表达情况，我们发现Ro31-8425，PD98059，LY294002均可明显改变CSE减少PDCD4含量的作用，而SB203580，SP600125没有明显作用。 结论： 1.原发性肝细胞肝癌中存在PDCD4含量减少的情况。吸烟与不吸烟者肿瘤组织中PDCD4含量没有明显差异，提示PDCD4作为肿瘤抑制物减少到一个临界点后发生了肝癌，之后可能由于某种反馈调节机制不再继续减少；吸烟者癌旁组织中PDCD4减少更加明显，提示吸烟肝癌患者预后较之不吸烟者可能更差。 2.肝癌细胞HepG2中PDCD4的含量较之正常肝细胞L02有明显降低，差异有统计学意义。 3.香烟燃烧提取物CSE可以导致正常肝细胞L02中PDCD4含量减少，但CSE并没有明显影响PDCD4的基因转录和翻译，提示CSE减少PDCD4蛋白水平这一作用可能是发生在翻译后的，可能是通过增加PDCD4的降解来实现的。 4.CSE可能是通过激活PI3K-Akt-p70S6K通路和PKC从而磷酸化PDCD4来使其降解的，在这一过程中，MEK-ERK通路可能发挥了必要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一部分 部分中国男性肝细胞肝癌患者中吸烟情况与PDCD4蛋白含量关系的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

第二部分 香烟提取物对人肝细胞系L02中PDCD4蛋白水平的影响及机制的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的论文