UVB照射对中华大蟾蜍早期胚胎蛋白质表达的影响

摘要

紫外线（UV）是一种非电离辐射光物理因子，其中的中波段紫外线即UVB对生物体有很重要的作用。为了研究UVB对两栖类动物早期胚胎发育的影响，本论文以中华大蟾蜍早期胚胎为实验材料，采用302 nm中波紫外线（UVB）照射不同发育时期的中华大蟾蜍胚胎，在发育形态、蛋白质谱和组织表达水平检测了UVB照射前后胚胎蛋白质表达的变化。1）以304μw/c㎡强度的UVB照射不同发育时期的中华大蟾蜍胚胎，观察记录胚胎的发育过程、统计存活率和畸变率与照射时期的关系。结果表明，UVB照射并不显著影响受精卵的孵化率；对较早时期胚胎（2细胞期～囊胚期）存活率的影响较复杂，可明显降低较晚时期胚胎（原肠胚～神经胚）的存活率；UVB照射后在不同发育时期，较早时期胚胎的畸变率也不同，而较晚时期胚胎的畸变率有明显的上升。2）提取UVB照射前后的中华大蟾蜍囊胚和神经胚总蛋白质进行双向凝胶电泳，胶体考马斯亮兰染色后成像，利用ImageMaster2D Platinum6．0图像分析软件进行分析。结果表明，UVB照射对胚胎蛋白质点的个数和分布都有显著影响：照射后囊胚变化的点129个，包括表达上调的点17个，表达下调的点11个，照射后消失或增加的点102个；神经胚照射后变化的点84个，包括表达上调的点10个，表达下调的点11个，照射后消失或增加的点63个。3）根据二维电泳分析结果，选取差异显著的点进行MALDI-TOF质谱分析，并利用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰并搜索NCBInr数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能。结果鉴定出来的有明确功能阐述的蛋白，包括照射后表达量减少的7种蛋白：67kD层粘连蛋白受体前体、过氧化物酶2、烯醇化酶1、类似热休克同源蛋白70、MGC82602蛋白、tRNA核苷酸转移酶前体、核蛋白A1b，以及照射后含量减少的4种蛋白：含缬酪肽蛋白、糖原磷酸化酶（脑型）、微管蛋白56D和caspase-7。这些蛋白都是参与细胞活动的重要蛋白，在UVB照射前后差异表达显著。4）以304μw/c㎡强度的UVB照射中华大蟾蜍囊胚、原肠胚和神经管期胚胎，制作石蜡切片，并进行caspase-3的免疫组织化学染色。结果表明UVB照射后，caspase-3在囊胚动物极表达加强而在植物极表达减弱。在原肠期胚胎中，表达caspase-3的阳性细胞数量增多。在神经管期胚胎中，胚胎头部caspase-3表达加强而腹部表达减弱。本论文中所讨论的UVB这一环境因子对两栖类胚胎影响的研究，有助于揭示生物体发育过程中光物理因素对其物种演化、变异所起的作用，以及特定光物理因素条件下生物的遗传适应性和胚胎发生的分子机理，并对环境保护和健康维护提供借鉴。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

声明

1前言

1.1阳光中的紫外线

1.1.1紫外线的分类

1.1.2紫外线与臭氧层

1.1.3紫外线的生物学作用

1.2中华大蟾蜍概况

1.2.1中华大蟾蜍研究概况

1.2.2自然环境对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响

1.3 Caspase-3和细胞凋亡

1.4双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4实验溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1 UVB照射前后中华大蟾蜍早期胚胎发育状态的观察

2.2.2 UVB照射前后胚胎胞浆蛋白和膜蛋白的SDS-PAGE检测

2.2.3 UVB照射前后胚胎总蛋白质的2-DE检测

2.2.4 UVB照射前后胚胎差异表达蛋白的质谱鉴定和分析

2.2.5 UVB照射前后差异表达蛋白质的Western blotting法鉴定

2.2.6 UVB照射前后胚胎中Caspase-3的免疫组织化学染色

3实验结果

3.1 UVB照射对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响

3.1.1中华大蟾蜍早期胚胎基本发育过程

3.1.2 UVB照射对中华大蟾蜍早期胚胎孵化率的影响

3.1.3 UVB照射对中华大蟾蜍早期胚胎存活率的影响

3.1.4 UVB照射对中华大蟾蜍早期胚胎畸形率的影响

3.1.5 UVB照射后产生的各种畸胚

3.2 UVB照射中华大蟾蜍早期胚胎蛋白质分析

3.2.1 UVB照射前后胚胎膜蛋白和胞浆蛋白质SDS—PAGE电泳结果

3.2.2 UVB照射中华大蟾蜍早期胚胎前后其总蛋白质2-DE电泳结果

3.3 UVB照射前后差异表达点的肽指纹图谱及Western blotting鉴定

3.3.1 UVB照射前后囊胚期胚胎差异表达点的肽指纹图谱

3.3.2 UVB照射前后神经胚差异表达点的肽指纹图谱

3.3.3 UVB照射前后差异表达蛋白的Western blotting法鉴定结果

3.4 UVB照射中华大蟾蜍胚胎前后Caspase-3表达状态的变化

3.4.1石蜡切片HE染色结果

3.4.2 Caspase-3免疫组化染色结果

4讨论

4.1 UVB对胚胎的损伤作用

4.2 UVB照射后对早期胚胎蛋白质的影响

4.3 UVB照射后Caspase-3的表达变化与畸胚的形成

5结语

参考文献

致谢

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