高压氧、2ME2和Cystamine对全脑缺血模型中凋亡相关因子的多重作用及对海马神经元的保护机制

摘要

第一部分高压氧对全脑缺血-低血压大鼠模型中缺氧诱导因子1-α和凋亡基因表达的多重作用
　　 [目的]①研究全脑缺血再灌注大鼠模型海马神经元凋亡的变化规律，探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在全脑缺血缺氧再灌注过程中的作用。②探讨严重缺氧引起的HIF-1α和p53过度表达是否激活促凋亡通路caspase-9和caspase-3，能够引起细胞凋亡这样的有害结果。③我们想通过实验检验高压氧治疗(HBO)是否是由于提高了大脑的供氧水平而产生了神经保护作用，或能够证明HBO的治疗作用是由于对HIF-1α和其下游凋亡基因表达的抑制而起作用。
　　 [材料和方法]材料：78只成年SD大鼠(370g)被随机分成13个组(每组数量n=6)：1个假手术组，6个全脑缺血再灌注组(GI)，分别为6h，12h，24h，48h，96h和7天组，6个全脑缺血再灌注+HBO治疗组(GI+HBO)，分别为6h，12h，24h，48h，96h和7天组。
　　 二血管闭塞全脑缺血模型(2VO)：该模型是由Smith1984年发明的，Sugawara做了些改进，我们有所完善。暴露大鼠颈部结构并股动脉抽血时血压保持在30-35 mmHg，随后，大鼠两边的颈总动脉被两个血管夹夹闭10分钟。10分钟后，抽出的血被注射回股动脉中，血管夹被松开。高压氧治疗(3个标准大气压持续两小时)在缺血-低血压1小时后开始。各组实验大鼠分别在6h，12h，24h，48h，96h和7天被断头取脑。
　　 Nissl染色和细胞计数：每只动物的海马CA1区在奥林巴斯叠加成像系统中定位扑捉以进行细胞数量的计算。每个区域中被计算出的Nissl染色细胞数量，CA1区细胞的密度被平均，以获得每只动物的平均值。
　　 免疫组化染色：将提供在大脑切片上海马CA1区HIF-1α阳性细胞和其它凋亡基因的分布信息。
　　 荧光双染标记：假如在相同神经元中HIF-1α与其它凋亡基因均呈阳性的话，提供了唯一的信息，即可认定HIF-1α和其它凋亡基因呈阳性细胞类型。
　　 TUNEL染色：提供DNA破碎的信息，这是凋亡的独特现象。
　　 蛋白质印迹分析：将提供HIF-1α和其他凋亡基因在神经组织定量变化的信息。每组取4只大鼠脑的样本用于免疫印迹染色的研究。大鼠在相应的时间点断头取脑用于蛋白质印迹分析。
　　 [统计分析]
　　 本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显著性差异，则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.)P<0.05被认为有显著性差异。
　　 [结果]
　　 Nissl染色：全脑缺血后24小时时间点，神经组织在海马区有脱失，而在缺氧的皮层神经元脱失成都较轻，在48小时时间点神经元脱失进一步加重，在7天时达到最大值。在所有时间点中，HBO治疗均减轻了脑组织神经元的脱失。全脑缺血-低血压后48小时-7天，海马CA1区的细胞数量明显少于正常对照组(P<0.05，ANOVA)。HBO治疗后48小时-7天海马CA1区的细胞数量与正常对照组有明显差异(P<0.05，ANOVA)
　　 TUNEL：全脑缺血-低血压损伤后12小时，较强的TUNEL阳性物质开始出现在海马中，而在皮层中TUNEL阳性物质相对较少。高倍镜显示TUNEL染色发生于神经核内。大脑样本中更强一些的TUNEL染色发生于全脑缺血后24-48小时。全脑缺血经HBO治疗后的样本中很少发现TUNEL细胞(尤其在12-24小时)，无论在海马或者皮层中均如此。
　　 免疫荧光染色显示，全脑缺血-低血压损伤后24小时，样本海马CA1有HIF-1α阳性细胞(细胞核中的红色)。在同一玻片上进行免疫荧光双染，在神经元细胞核内(绿色)，TUNEL呈现阳性染色。将两个复合体融合在一起，证明了海马神经元细胞核中TUNEL与HIF-1α的定位(黄色)，这也提示了HIF-1α在凋亡细胞中表达。免疫荧光图片显示，HIF-1α仅出现于神经元的细胞核内而不在细胞浆内。
　　 p53，caspase-9和caspase-3的免疫组化表达：在正常对照组的海马和皮层中我们观察到p53，caspase-9和caspase-3免疫组化染色的阴性结果。在全脑缺血-低血压损伤后24小时，可以观察到在海马及皮层p53，caspase-9和caspase-3免疫组化染色强阳性结果。高倍镜下观测样本玻片显示在海马和皮层p53，caspase-9和caspase-3免疫组化染色阳性的神经元。在全脑缺血-低血压损伤后24小时，可以观察到在海马CA1区的神经元免疫荧光双染显示p53(绿)和HIF-1α(红)在神经元核内阳性染色。另外，caspase-9(绿)和caspase-3(绿)在细胞质内的染色呈阳性，HIF-1α(红)阳性染色在细胞核内成阳性染色。
　　 Caspase-8和bcl-2的免疫印迹染色表达：关于caspase-8和bcl-2我们获得了意象之外的结果.全脑缺血一低血压损伤后6小时，在缺血的大脑皮层，caspase一8的蛋白表达与正常对照组比较明显升高，在12小时达到高峰，24小时-7天持续维持在一个较高的水平(P<0.05，GI Vs.control，ANOVA)。HBO治疗未能改变caspase-8的蛋白表达的峰值，但却极可能亦不加强了caspase-812小时至7天的表达水平(P<0.05，GI+HBO vs.GI)。更有意思的是全脑缺血-低血压损伤后6小时bcl-2的蛋白表达显著升高，然后不断升高在7天时达到高峰(P<0.05，GI vs.control，ANOVA)。HBO治疗在所有时间点均显著地降低了bcl-2的蛋白表达(P<0.05，GI+HBO vs.GI)。与正常对照组比较，除了24小时(P<0.05 vs.control)以外HBO治疗均降低了bcl-2的蛋白表达水平(P>0.05 vs.control)。
　　 [小结]
　　 全脑缺血-低血压(10分钟全脑缺血，同时血压保持在30-35mmHg)导致大鼠海马和大脑皮层HIF-1α的表达在6小时明显升高，48-96小时达到高峰。p53，caspase-9和caspase-3的表达在相同的时间点均明显升高。这些分子生物学的变化同时伴有海马区神经细胞的大量脱失，大脑皮层的神经细胞也有程度略小一点的脱失，这种细胞脱失有明显的细胞凋亡的特征。HBO能明显减少HIF-1α，p53，caspase-9和caspase-3的表达，减少神经细胞的死亡。促凋亡基因caspase-8和抗凋亡基因bcl-2的蛋白水平在全脑缺血后均升高。HBO增加了caspase-8的表达，减少了bcl-2的表达。研究结果显示：尽管全脑缺氧后进行HBO整体上是降低HIF-1α的表达，减少神经细胞的凋亡，但是HBO对凋亡基因具有多重作用。
　　 第二部分HIF-1α的抑制因子2ME2及survivin和caspase-3在全脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制
　　 [目的]缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是一个的由缺氧特异性激活的转录因子。促凋亡通路capase-3可被HIF-1α及p53激活，能够引起像细胞凋亡这样的有害作用。而survivin作为抗凋亡基因能够直接抑制capase-3的表达而减轻细胞的凋亡[1]。进一步的研究提示，survivin是caspase-3，caspase-7的抑制剂[3]。同时有试验证明HIF-1α有抑制survivin表达的作用[2，3]；也有试验表明HIF-1α有上调survivin表达的作用[4]。2ME2是否通过HIF-1α抑制剂，我们想通过实验检验2ME2是否通过抑制HIF-1α的表达而增强或减弱了survivin的表达，是否起到脑保护作用或脑损害作用。
　　 [材料和方法]雄性SD大鼠(n=78)被随机地分成13个组(n=6，每组)：1个假手术组，6个全脑缺血再灌注(GI)，6个全脑缺血再灌注加2ME2治疗组(GI+2ME2)。全脑缺血10分钟取下动脉夹后，立即给予2-甲氧基雌二醇腹腔注射(16mg/kg体重)，大鼠分别在6h，12h，24h，48h，96h和7天时被断头取脑。统计方法：本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显著性差异，则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiplecomparison procedure.)P<0.05被认为有显著性差异。数据用SPSS11.5软件包做统计分析。
　　 [结果]全脑缺血10分钟导致大鼠海马HIF-1α和P53的表达在6小时明显升高，48-96小时达到高峰。survivin的表达在相同的时间点均略有升高，而caspase-3的表达明显升高。这些分子生物学的变化同时伴有海马区神经细胞的大量脱失，这种细胞脱失有明显的细胞凋亡的特征。2ME2能明显减少HIF-1α表达[5]，使survivin受到的抑制减弱而表达明显增加，从而减少了caspase-3的表达。
　　 [结论]研究结果显示：全脑缺氧后给予2ME2治疗，整体上是2ME2抑制HIF-1α的过度表达，HIF-1α对survivin的抑制作用减弱，继而上调了survivin的表达，survivin抑制了caspase-3的表达从而减少神经细胞的凋亡[2]。
　　 第三部分
　　 Cystamine对tTG、NPM、p53、caspase-3表达的影响及对全脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元凋亡的保护作用
　　 [目的]
　　 ①研究全脑缺血再灌注大鼠模型海马神经元凋亡的变化规律，探讨组织型转谷氨酰胺酶(tTG)，被tTG抑制的核磷蛋白(NPM)，及相关的p53和caspase-3在海马缺血再灌注后的相互作用关系。②缺血再灌注后，应用组胺(cystamine，CYS)作为tTG干预抑制剂，其对于tTG下游相关基因NPM、P53和caspase-3的影响。③通过对tTG的抑制剂cystamine与tTG及其相关基因核磷蛋白和p53和caspase-3相互作用关系的研究，探讨cystamine的保护海马神经元的作用机制。
　　 [材料和方法]
　　 采用4血管阻断法制作大鼠全脑缺血模型，脑电图验证成功与否。104只SD大鼠随机分为、假手术组(Sham)、全脑缺血组(GI)、全脑缺血+cystamine治疗组(GI+CYS)3组，其中Sham组8只，GI组、GI+CYS组各48只大鼠。GI组和GI+CYS组，按照再灌注后6小时、12小时、1天、3天、5天和7天随机分各为6个亚组，每个亚组8只大鼠。其中GI+CYS组于双侧颈总动脉夹闭10分钟后立即给予cystamine(150mg/kg)腹腔注射，缺血时间在24小时内的只在缺血后给予一次cystamine(150mg/kg)腹腔注射，超过1天的在相应时间点各给予cystamine150mg/kg。Sham组仅暴露两侧椎动脉及颈总动脉，不予电凝及夹闭，每天给予生理盐水1ml腹腔注射，于第3天处死。将GI组和GI+CYS组大鼠分别在相应时间点，经灌流固定后取脑。
　　 TUNEL染色检测再灌注后不同时间点海马CA1区的神经元凋亡水平。用原位凋亡专用试剂盒处理后，利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区FUNEL阳性细胞数。
　　 免疫组织化学方法检测缺血再灌注后不同时间点海马CA1区tTG、NPM、p53、和caspase-3表达水平的变化，利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区免疫组化阳性细胞数。
　　 蛋白质印迹分析方法检测缺血再灌注后不同时间点亚组和CYS治疗组各个时间点亚组海马tTG、NPM、p53、和caspase-3表达水平，用BioRadio半定量方法测定各因子表达情况。
　　 统计方法：本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显著性差异，则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.)P<0.05被认为有显著性差异。数据用SPSS11.5软件包做统计分析。
　　 [结果]
　　 TUNEL染色：GI组海马CA1区TUNEL阳性细胞明显增加，1天、3天、5天、7天亚组与Sham组相比有统计学差异(p<0.05)；GI+CYS组再灌注24小时后TUNEL阳性细胞有少量增加，在相应的1天、3天、5天、7天的时间点亚组，GI+CYS组的TUNEL细胞数目比GI组的明显少，具有统计学意义(p<0.05)。
　　 免疫组织化学：1.tTG、NPM和p53的表达：Sham组海马CA1区有一定数量的tTG和p53的表达；GI组与Sham组比较其12小时、1天、3天亚组的tTG和p53的表达)均明显升高，具有统计学意义(P<0.01)；GI+CYS组的tTG和p53的表达明显减弱，再灌注7天仍维持在较低水平；与GI组相比，1天、3天、5天、7天亚组tTG和p53的表达显著降低，具有统计学意义(P<0.01)，12小时亚组tTG和p53的表达水平略高于GI组，计算无统计学意义(P>0.01)的表达。NPM的表达：Sham组海马CA1区有一定数量的NPM表达。GI组与Sham组比较其12小时、1天、3天亚组的NPM的表达均明显降低，具有统计学意义(P<0.01)；GI+CYS组的NPM表达明显增强，再灌注7天仍维持在较高水平；与GI组相比，1天、3天、5天、7天亚组NPM的表达显著增加，具有统计学意义(P<0.01)。2.caspase-3的表达：caspase-3蛋白在假手术组大鼠海马CA1区中极少见阳性表达；GI组caspase-3蛋白的表达于再灌注6小时可见增加，3天达高峰，7天降至接近正常水平；GI+CYS组caspase-3表达与GI组相比明显减低，但仍高于假手术组，表达变化趋势同GI组，GI+CYS组中1天、3天、5天和7天亚组与GI组相应时间点亚组相比有显著性差异(P<0.05)。
　　 蛋白质印迹分析：缺血组tTG蛋白表达在全脑缺血再灌注后6h和12h表达较弱，于全脑缺血再灌注后1d开始升高，于全脑缺血再灌注3d、5d、7d亚组显著高，与假手术组相比，3d、5d、7d时间点亚组蛋白表达升高的差异有显著性意义(P<0.05)；CYS治疗组海马tTG蛋白水平于缺血再灌注后1d开始升高，于3d、5d、7d时间点亚组亦逐渐减弱，但相应各个时间点均显著低于缺血组(p<0.05)；全脑缺血再灌注后，海马神经元NPM蛋白表达水平6小时的表达较正常对照组明显减弱，12小时NPM表达明显恢复，1天时间点恢复至与正常对照组水平，然后在3天、5天和7天保持较高的水平。CYS治疗后NPM蛋白表达水平从6小时开始升高，1 d时达到高峰，3d，5d，7d均保持较高的表达水平，CYS治疗后，治疗组各个时间点NPM的蛋白表达水平均明显高于缺血组，比较有显著差异(p<0.05)；全脑缺血再灌注后，海马神经元p53蛋白表达水平从6小时开始积聚升高，到7天时接近正常水平；CYS治疗后，治疗组各个时间点p53蛋白表达水平6 h，12h和1d时间点明显低于缺血组，比较有显著差异(p<0.05)。
　　 缺血组caspase-3蛋白表达于缺血再灌注6h即明显升高，从3的开始下降，单直至7d仍处于较高水平(P<0.05)；治疗组caspase-3蛋白水平于再灌注后6h，12h，1d、3d、5d、7d各亚组较缺血组均明显减低，相应时间点的比较有显著性差异(p<0.05)。
　　 [结论]
　　 全脑缺血再灌注损伤可以诱导核磷蛋白(NPM)表达的下调，同时导致组织型转谷氨酰胺酶(tTG)、p535和caspase-3表达上调，从而导致海马神经元的损伤，最终神经元凋亡，我们认为神经元的凋亡是与tTG，NPM，p53和caspase-3这个细胞信号传递系统有重要相关的。CYS能够抑制tTG的表达，而tTG的表达抑制导致了下游通常被抑制状态的核磷蛋白的过度表达，核磷蛋白的过度表达减少了p53在线粒体内的水平；同时核磷蛋白还直接(或间接)抑制了caspase-3的表达，这个过程可能是全脑缺血再灌注损伤后CYS保护海马神经元免于凋亡的作用机制。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前 言

第一部分 高压氧对全脑缺血大脑模型中缺氧诱导因子1-α和凋亡基因表达的多重作用

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 HIF-1 α的抑制因子2ME2及survivin和caspase3在全脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 Cystamine对tTG、NPM、p53、caspase-3表达的影响及对全脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元凋亡的保护作用

前言

材料和方法

结 果

讨 论

结论

附 图 表

参考文献

全文总结

致谢

文献综述

参考文献

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