深海沉积物细菌和丝状真菌的基因组学研究

摘要

海洋是地球上最重要的生态系统之一,其中蕴藏着种类繁多的微生物类群,是获取新药和新酶的宝贵资源,具有很好的开发前景。地球表面的60％被深度超过1000米的海水所覆盖,并且深海区地球表面覆盖着生物和非生物来源的深海沉积物。由于巨大的广度和深度,海底沉积物和上部洋壳是地球上最大的生态系统之一,蕴藏着巨大的生物特别是微生物资源。海洋底部是一个极端环境,是嗜冷、嗜热、嗜压、嗜盐和嗜低营养等嗜极端环境微生物的理想来源。对这些极端微生物的研究开发将会在工业应用、医药应用、环境保护等方面具有潜在的、巨大的应用价值。但是由于采样和培养困难,对深海沉积物微生物资源的开发还远远不够。因此,对深海沉积物中微生物资源的发现和开发就具有重要的意义。
　　 本论文研究内容首先是对一株分离自南冲绳海槽深海沉积物的细菌SM.A87进行了菌种鉴定。然后对菌株SM-A87进行了全基因组测序,以期通过基因组信息揭示其在深海沉积物PON降解中的作用。Pseudoalteromonas sp.SM9913是从冲绳槽附近海域1855米深的海底沉积物中分离的深海适冷菌。能分泌大量的胞外多糖和适冷蛋白酶。本论文对其全基因组序列进行了测序和分析,并与南极浅海适冷菌Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125进行了比较基因组学的研究。以期发现假交替单胞菌属内深海细菌对深海环境适应的独特机制。Trichodermapseudokoningii SMF2是分离自海滩土壤的一株丝状真菌。其对线虫有杀伤作用,并且其分泌的次级代谢物哌珀霉素有抗菌和抗肿瘤活性。本论文对其基因组进行了测序和分析。希望能够发现哌珀霉素的产生途径并为以后的研究做好基础。
　　 菌株SM-A87的菌种鉴定:SM-A87分离自南冲绳海槽深海沉积物海底表层下2米,海水深度为1245米。SM-A87革兰氏染色为阴性,无游动和滑动能力。在海水LB平板上28℃培养48h后,菌落呈黄色到橘红色,菌落圆形且紧贴平板,不透明,直径2-3mm,高1.2mm。菌体细胞呈短杆状,长约1.5-3.3μm,宽约0.3-0.6μm。长期培养可形成球状菌体。
　　 SM-A87是严格好氧菌,氧化酶和接触酶阳性。产黄色色素,不形成芽孢。能在4-38℃范围内生长,最适生长温度范围为25-30℃。生长的pH范围是pH5.0-8.5,能在0-12％的NaCl浓度下生长,最适生长NaCl浓度为3％。SM-A87含有黄杆菌科主要的呼吸醌MK-6。含有Flexirubin色素,主要合成末端分支的脂肪酸。
　　 SM-A87的DNA G+C含量为35.8mol％。通过16S rRNA基因系统进化树分析发现,与SM-A87最相近的菌株为黄杆菌科的Salegentibacter holothuriorum,两者的16S rRNA基因序列相似性为92.9％。另外,SM-A8716S rRNA基因序列与同属于黄杆菌科的Mesonia algae和Gramella portivictoriae相似性分别为91.8％和91.5％。
　　 综合传统分类学、化学分类学和分子系统学分类的结果,将SM-A87归类为黄杆菌科的一个新属新种,定名为Wangia profunda。最后属名在InternationalJournal of Systematic and Evolutionary.Microbiology(IJSEM)Validation List no.116上更改为Zunongwangia。
　　 Zunongwangia profunda SM-A87基因组学研究:SM-A87的全基因组只有一条染色体,长度为5128187bp,含有4653个预测的ORF,ORF平均长度为960bp。有47个tRNA基因和3个rRNA操纵子。是目前为止Bacteroidetes第一个被测序的深海沉积物细菌。基因组中含有糖酵解,戊糖磷酸途径和三羧酸循环的全部基因以及ED代谢途径的关键酶。这反应了SM-A87代谢途径的多能性。
　　 SM-A87可以产生大量的荚膜多糖,基因组分析发现其基因组有两个多糖合成和输出的基因簇。SM-A87可以编码大量分泌型的水解酶。其中在130个肽酶中,61个带有信号肽。并且带信号肽的肽酶比不带信号肽的肽酶更有嗜盐特性,这有利于SM-A87在海水环境中对胞外蛋白质进行更好的水解。其胞外肽酶主要以金属肽酶和丝氨酸肽酶为主。SM-A87中与糖类分解和转运相关的酶也比较多。因此,深海来源的Bacteroidetes的菌株具有很强的对胞外有机碳和有机氮降解的能力。
　　 SM-A87中有两个CRISPR位点。第一个位点为5595bp,第二个位点为2115bp。CRISPR被认为与抗病毒有关,但是SM-A87的两个CRISPR位点的间隔区序列在现有病毒库中搜不到同源序列。这可能是由于现有病毒数据库中仅包含了海洋病毒的很少一部分序列的因为。
　　 SM-A87能耐受0-12％的NaCl,是中度嗜盐菌。嗜盐蛋白具有比较多酸性氨基酸残基从而使自身等电点比较低。通过预测SM-A87基因组全蛋白的等电点来预测其耐盐特性。SM-A87胞外蛋白的等电点明显低于胞内蛋白的等电点,说明其胞外蛋白比胞内蛋白更具有嗜盐性。同时也说明SM-A87胞内的盐离子浓度不是很高,很可能是通过富集有机物来维持其细胞内外渗透压平衡。其基因组能编码甜菜碱转运子也验证了这个推论。
　　 Pseudoalteromonas sp.SM9913基因组及比较基因组学研究:P.sp.SM9913(简称 SM9913)是一株深海适冷菌,最适生长温度为15℃。P.haloplanktisTAC125是分离自南极表层海水的适冷菌,并且基因组已经测序完成。SM9913基因组由两条染色体组成,大小分别为3.3Mb(染色体Ⅰ)和700kb(染色体Ⅱ),与P.haloplanktis TAC125(简称TAC125)两条染色体的大小和结构都很相似。SM9913的两个染色体共含有3711个ORF,其中66.9％可以注释上已有的或预测的功能。62个tRNA基因和8个rRNA操纵子以及一个额外的5S rRNA基因都位于染色体I上。
　　 根据16S rRNA基因构建的进化树表明SM9913和TAC125在进化关系上是非常接近的。SM9913和TAC125的平均核苷酸相似度为85％,说明SM9913和TAC125是假交替单胞菌属不同的种但是具有很高的相似性。两者共有2698个直系同源基因,分别占SM9913和TAC125全部基因的72.7％和77.4％。SM9913中共鉴定出了12个长度大于15kb的基因岛(gene island,GI)。其中11个位于染色体Ⅰ,一个位于染色体Ⅱ。基因岛中的基因大部分是在TAC125中没有直系同源基因的SM9913特有基因,所以这些基因岛的特有基因会赋予SM9913一些区别于TAC125的特性。
　　 与TAC125相比,SM9913中双加氧酶个数比较少并且缺少TAC125中与H2O2抗性相关的脂肪酸代谢基因簇。因此推测SM9913对H2O2比较敏感。实验结果也证实了这一点,SM9913只能在5mM H2O2浓度下生长,而TAC125可以在10-15mM H2O2浓度下生长。这可能是因为深海沉积物中氧气浓度比较低,导致ROS(reactive oxygen species)的产生量比较少,从而使SM9913只能耐受低浓度的H2O2。

目录

文摘

英文文摘

符号说明及缩写词

第一章 研究背景和立题依据

1.1 研究背景

1.1.1 深海沉积物微生物

1.1.2 微生物基因组研究进展

1.1.3 微生物基因组研究进展

1.2 本论文开展思路及研究内容

第二章 南冲绳海槽深海沉积物菌株SM-A87的菌种鉴定

2.1 实验材料、仪器和试剂

2.1.1 菌株样品

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂和试剂盒

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 数据库及分析软件

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的分离和保存

2.2.2 表型特征研究

2.2.3 生理生化特征

2.2.4 化学分类特征

2.2.5 基因型特征

2.2.6 系统发育学分析

2.3 结果与分析

2.3.1 形态学观察结果

2.3.2 化学分类结果

2.3.3 生理生化结果

2.3.4 系统发育学分析

2.4 讨论

第三章 Zunongwangiap,profunda SM-A87全基因组测序及分析

3.1 实验材料、仪器和试剂

3.1.1 菌株

3.1.2 培养基

3.1.3 主要分子试剂和试剂盒

3.1.4 主要仪器与耗材

3.1.5 数据库和分析软件

3.2 实验方法

3.2.1 菌体培养及DNA提取

3.2.2 454测序

3.2.3 fosmid文库构建及测序

3.2.4 小片段质粒文库构建及测序

3.2.5 基因组的finishing与质量检查

3.2.6 基因组注释

3.2.7 基因组分析

3.3 结果与分析

3.3.1 SM-A87基因组概况

3.3.2 基本代谢途径分析

3.3.3 对外界环境感知系统

3.3.4 多糖合成

3.3.5 水解能力

3.3.6 氮和硫的代谢

3.3.7 CRISPR

3.3.8 可移动元件

3.3.9 嗜盐适冷特性分析

3.4 讨论

第四章 Pseudoalteromonas sp.SM9913全基因组测序及比较基因组学研究

4.1 实验材料、仪器和试剂

4.1.1 菌株

4.1.2 培养基

4.1.3 主要分子试剂和试剂盒

4.1.4 主要仪器设备

4.1.5 数据库和分析软件

4.2 实验方法

4.2.1 菌体培养及DNA提取

4.2.2 454测序

4.2.3 小片段文库构建及测序

4.2.4 基因组的finishing与质量检查

4.2.5 基因组注释与分析

4.2.6 表型分析和比较

4.3 结果与分析

4.3.1 基因组概况

4.3.2 信号转导基因分析

4.3.3 可移动元件

4.3.4 对过氧化氢的敏感性

4.3.5 胞外多糖合成

4.3.6 抗生素和重金属离子耐受性

4.3.7 鞭毛和运动性

4.3.8 其他基因岛及相关特性

4.4 讨论

第五章 丝状真菌Trichoderma pseudokoningii SMF2基因组测序和分析

5.1 实验材料、仪器和试剂

5.1.1 菌株

5.1.2 培养基

5.1.3 主要分子试剂和试剂盒

5.1.4 主要仪器与耗材

5.1.5 数据库和分析软件

5.2 实验方法

5.2.1 菌体培养及DNA提取

5.2.2 Solexa测序及序列组装

5.2.3 基因组注释

5.2.4 转录组测序

5.2.5 基因组比较分析

5.3 实验结果

5.3.1 基因组序列数据

5.3.2 胞外蛋白酶分析

5.3.3 GO功能分类分析

5.4 讨论

全文总结

一、本论文取得的创新性结果

二、本论文存在的问题及深入方向

参考文献

在读期间发表的论文目录

致谢

外文论文

学位论文评阅及答辩情况表