Th17相关细胞因子在实验性变态反应性神经炎中的作用

摘要

研究目的
　　 格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是一种常见的外周神经自身免疫性疾病,其病理特点为周围神经的炎性细胞浸润和脱髓鞘改变,具体病因和发病机制尚不十清楚。实验性变态反应性神经炎(experimentalautoimmuneneuritis,EAN)是CD4+T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病,被公认为研究GBS的理想动物模型。
　　 Th17细胞是最近研究发现的新的辅助T细胞亚群,其各种特性与Th1和Th2细胞不同,可以产生白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素17F(IL-17F)、白细胞介素22(IL-22)等细胞因子。IL-17为其特征性效应细胞因子,具有强烈的致炎作用,白细胞介素23(IL-23)作为新发现的促炎性细胞因子,在Th17细胞的扩增与维持中发挥重要作用。目前研究证实,Th17细胞在自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、类风湿关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)等发病机制中发挥了重要作用,其是否与EAN发病有关,目前尚不清楚。
　　 本研究通过建立EAN大鼠作为GBS的动物模型,检测EAN大鼠坐骨神经中Th17细胞相关细胞因子IL-17和IL-23蛋白及mRNA的动态表达,探讨Th17细胞相关细胞因子IL-17、IL-23在在EAN发病中的作用及其机制,以期为自身免疫性疾病的治疗提供新靶点。
　　 研究方法
　　 1.抗原制备:采用超速离心法自牛脊神经根提取周围神经髓磷脂(boyineperipheralnervemyelin,BPM)。
　　 2.实验动物:7-8周龄雌性Lewis大鼠32只,体重160-180g,随机分为EAN组(n=24)和对照组(n=8)。EAN组又随机分为免疫后9d(疾病早期组)、15d(疾病高峰期组)、21d(疾病恢复期组),每组8只。SPF级饲养。
　　 3.EAN模型的建立及临床评分:大鼠适应性饲养1周,10％水合氯醛(300mg/Kg)麻醉。将100μL抗原乳剂(含BPM5mg、结核杆菌1mg、不完全弗氏佐剂50μL、生理盐水50μL)注入EAN各组大鼠双侧后肢足垫皮下。对照组每只注射等量弗氏不完全佐剂和结核杆菌。于免疫前即时及免疫后每日进行临床评估,直至免疫后21天。临床评分:0:正常；0.5:全尾肌张力下降；1.0:尾部肌肉瘫,松软拖地；1.5:轻微后肢无力,肌张力下降；2.0:明显后肢无力或轻度后肢瘫；2.5:中度后肢瘫；3.0:严重后肢瘫；4:严重四肢瘫。
　　 4.动物标本取材:观察大鼠的发病情况,分别在免疫后第9天,第15天,第21天处死EAN大鼠,对照组大鼠于第21天处死。无菌状态下取双侧坐骨神经,一侧坐骨神经固定于4％多聚甲醛中,备做组织病理学和免疫组化检测。另一侧坐骨神经存放于-80℃冰箱中,备做RT-PCR。
　　 5.组织病理学检查:取4％多聚甲醛固定的坐骨神经,石蜡包埋,纵行切片(5-6μm,每根神经2张连续切片),HE染色,观察大鼠坐骨神经中病理学变化。
　　 6.免疫组化检测:大鼠坐骨神经石蜡切片,常规脱蜡致水,经阻断内源性过氧化物酶活性、抗原修复、牛血清白蛋白封闭处理,分别滴加一抗(兔抗大鼠IL-17、IL-23多克隆抗体)和二抗(辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG),DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封固。40倍物镜下采集图像,观察大鼠坐骨神经中细胞阳性反应,结果以细胞数/高倍视野表示。
　　 7.RT-PCR检测:取各时间点坐骨神经50mg,按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA,采用紫外分光光度法定量,取1μg总RNA用M-MLV合成cDNA。以B-actin为内参照分别扩增IL-17和IL-23。采用BioRad公司的图形分析软件QuantityOne对RT-PCR产物的电泳条带进行灰度扫描,以条带的平均吸光度和条带面积的乘积代表信号强度,分别计算各例IL-17/B-actin和IL-23/β-actin值。
　　 应用SPSS13.0软件对数据资料进行统计分析,数据以x±s表示。应用单因素方差分析进行组间比较,组间差异有统计学意义则用SNK法或Bonferroni法进行组间两两比较。
　　 结果
　　 1.EAN大鼠于免疫后9d开始出现临床症状,15d到达疾病高峰,第21d基本完全恢复,各组临床评分与对照组相比差异显著(P<0.05)。
　　 2.EAN大鼠坐骨神经中IL-17蛋白及mRNA在免疫后第15天表达均达到最高点,以后逐渐下降,且各组与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。
　　 3.EAN大鼠坐骨神经中IL－23蛋白及mRNA在免疫后9d表达最多,随后逐渐下降,9d、15d与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。
　　 结论
　　 1.IL－17可能是参与EAN发病的重要细胞因子,并与EAN的疾病进程有关。
　　 2.IL－23可能在EAN的诱导阶段起一定作用。

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