盐芥TsNPT启动子的功能分析及其上游结合蛋白的克隆

摘要

组成型启动子是植物基因工程中广泛应用的启动子类型之一，可启动外源基因在受体植物中非特异性的稳定的表达，但不能从时间和空间上对外源基因的表达进行有效的调控，这可能会造成植物在能源利用上的浪费，甚至会对转基因植物造成伤害。组织特异型启动子或者诱导型启动子可以启动外源基因在受体植物的特定组织器官中或者在特定的环境条件下高效表达，克隆和研究组织特异型启动子和诱导型启动子，可为植物基因工程改良提供重要的实验材料。在本工作中，以实验室克隆的盐芥Na+/Pi转运体基因TsNPT的启动子为材料，通过启动子功能汾析确定了一段叶特异性表达和盐胁迫响应相关的核心区域并筛选得到其上游的结合蛋白，为进一步探究该启动子的表达模式以及盐芥的基因表达调控机制提供了一定的资料。
　　 通过在线启动子分析软件进行分析，在TsNPT启动子区域中共鉴定出21个可能作用的顺式作用元件。它们可能参与了包括环境响应和组织特异性表达在内的多种调节途径。为了了解启动子不同区段对基因表达的影响，我们对该启动子序列进行了5’系列缺失，然后与GUS报告基因连接形成融合基因(启动子缺失体序列由长到短分别命名为D1-D8)，再将后者转入拟南芥，获得转基因纯合株系。对转基因株系DI（TsNPT全长启动子连接GUS报告基因）的植株进行染色分析得出：在TsNPT全长启动子的作用下，GUS基因在不同的组织中的表达强度存在差异，在叶中的表达量要远远高于其在根中的表达量。D1植株进行盐胁迫处理，比较处理前后的染色强度，发现在盐胁迫处理后GUS活性明显升高，尤其在叶中。GUS酶活性测定结果也验证这一结论。
　　 对正常生长条件下的D2、IM-D7转基因植株进行染色观察发现，叶中GUS的活性要明显高于根中的。这与DI植株的染色结果相一致。但D3材料与这些材料相比，其GUS活性有明显的降低，尤其是在叶中。在D8植株中，GUS只在维管组织中有微弱的表达，其表达强度与D7相比有明显的下降。对这一系列5’缺失突变体的转基因植株进行盐胁迫处理并进行染色观察，得出D2、D3、D4、D5、D6和D7株系的植株在盐胁迫条件下GUS活性有一定的上调，在叶中尤为明显，这与D1株系的分析结果相一致。而在D8植株中未出现这种诱导作用。在盐胁迫处理前后，D8植株只在维管组织中有微弱的GUS活性。上述结果表明，该启动子有两个显著的特点：叶器官高效表达和盐胁迫响应。这两个特性均与-365到-232这段134bp的序列有关，推测这段序列在该启动子的叶器官特异表达以及盐胁迫响应中起关键的作用。
　　 根据上述试验结果.我们通过酵母单杂交技术筛选了与核心DNA序列相结合的上游蛋白。酵母单杂交筛选到30个克隆，根据菌落PCR的结果从中挑取23个克隆提取质粒进行测序，发现其中15个插入基因编码盐芥组蛋白H3.2。推测盐芥中的组蛋白H3.2在酵母体内与该片段有强的结合。为了验证这一结果，我们在大肠杆菌中表达盐芥组蛋白H3.2并进行了纯化，利用纯化的重组蛋白、盐芥核蛋白和盐芥总蛋白分别与上述的134bp片段进行体外结合试验，证实了这种结合的特异性。同时还将盐芥组蛋白H3.2基因插入植物表达载体转化烟草，得到了转基因烟草植株用于后续试验。上述结果为对探讨盐芥耐盐机制以及基因调控机制提供重要的资料。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

1.1 启动子的概念和分类

1.1.1 启动子的概念

1.1.2 启动子的分类

1.2 转录因子

1.2.1 转录因子的概念

1.2.2 转录因子作用的分子机理

1.2.3 植物中逆境相关的转录因子

1.3 NA+／PI转运体简介

1.3.1 植物中其他的磷转运体蛋白基因

1.3.2 盐芥中的Na+／Pi转运体基因

1.4 本课题研究的目的及意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株和质粒载体

2.1.3 培养基及药品试剂

2.2 试验方法

2.2.1 质粒的重组和转化

2.2.2 启动子的信息学分析以及缺失体的构建

2.2.3 拟南芥的转化和筛选

2.2.4 转基因拟南芥的分子生物学检测

2.2.5 转基因拟南芥拟南芥的GUS荧光活性测定

2.2.6 构建酵母单杂交所用诱饵质粒

2.2.7 盐芥总RNA的提取和cDNA合成

2.2.8 酵母菌株Y187的遗传转化

2.2.9 组蛋白H3.2基因的克隆

2.2.10 TsH3.2蛋白原核细胞表达

2.2.11 盐芥总蛋白及核蛋白的提取

2.2.12 凝胶阻滞试验测定目的蛋白与DNA结合活性

2.2.13 农杆菌介导的烟草遗传转化

第三章 试验结果

3.1 启动子序列的信息学分析

3.2 启动子5’缺失体载体的构建

3.3 转基因拟南芥的筛选以及PCR鉴定

3.4 转DI结构的拟南芥植株分析

3.5 盐胁迫对转基因株系DI的GUS基因表达的影响

3.6 转不同缺失结构植株的染色分析

3.7 转基因植株不伺组织的GUS酶活性测定

3.8 酵母单杂交筛选

3.8.1 诱饵质粒的构建

3.8.2 盐芥cDNA文库的制备

3.9 利用酵母单杂交试验筛选目的蛋白

3.9.1 筛选浓度以及文库质量的测定

3.9.2 诱饵质粒与盐芥cDNA共转化酵母Y187

3.10 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

3.11 目的蛋白与DNA片段的结合试验

3.12 TSH3.2基因转化烟草

第四章 分析与讨论

4.1 TSNPT启动子的-365到-232片段存在叶特异表达和盐胁迫响应的作用元件

4.2 盐芥组蛋白H3.2有可能在基因表达调控和植株抗逆机制中起重要作用

参考文献

致谢

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