引入甘氨酸甲基化合成甜菜碱途径提高黑麦草抗旱性研究

摘要

黑麦草是世界范围内广泛种植的冷季型牧草和草坪草。一年生黑麦草(Lolium multiflorum Lam.)和多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是两个重要的黑麦草栽培种。由于黑麦草高度自交不亲和，通过传统育种方法进行遗传改良复杂而困难。基因工程技术的发展和应用，打破了物种间基因流动的限制，能将外源基因导入改良植物特定的性状。目前，全球水资源短缺问题日益严峻，干旱严重影响作物产量，而黑麦草耐旱能力弱。因此提高抗旱性是黑麦草育种的主要目标之一，利用生物技术培育黑麦草抗旱新品种具有重要的经济意义和科学意义。
　　 甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)在增强植物抗旱性中有重要作用，通过基因工程途径提高细胞甜菜碱含量改善植物抗逆性的研究已有较多工作。甜菜碱可通过胆碱氧化途径和甘氨酸连续甲基化途径合成，其中前一途径研究较早，一些参与该途径的酶基因已被克隆并应用于植物抗逆基因工程研究。后一途径近年才发现，目前有关参与该途径的酶基因克隆及利用的工作报道很少。以甘氨酸为底物合成甜菜碱，由于甘氨酸在细胞内浓度较高，甜菜碱的大量积累受限较少，因此克隆相关基因的工作受到关注。本论文首先从蓝细菌嗜盐隐杆藻GR02中克隆得到两个甲基化酶基因ApGSMT2和ApDMT2，它们在转基因大肠杆菌和转基因烟草中能够有效催化甘氨酸甲基化合成甜菜碱。然后将它们插入单子叶植物表达载体中，通过农杆菌介导的黑麦草从生芽块遗传转化方法将ApGSMT2和ApDMT2基因转入一年生黑麦草和多年生黑麦草中，获得了稳定的转基因株系，进而开展转基因黑麦草抗旱特性的研究，较深入揭示了转基因黑麦草抗旱性提高的机理。ApGSMT2和ApDMT2基因的克隆和功能确定根据已报道的嗜盐隐杆藻来源的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶基因(ApGSMT)和二甲基甘氨酸甲基转移酶基因(ApDMT)序列设计PCR引物，我们从南京大学分离的嗜盐隐杆藻GR02中克隆出两个DNA片段，分别长798 bp和834 bp，各自包含一个开放阅读框(ORF)。利用生物信息学方法对这两条DNA片段进行序列分析和编码产物的结构预测，发现它们与各种来源的转甲基酶序列相似性较高，它们可能分别编码甘氨酸肌氨酸甲基转移酶和二甲基甘氨酸甲基转移酶。将这两条DNA片段分别命名为ApGSMT2和ApDMT2。与已报道的ApGSMT和ApDMT基因相比，ApGSMT2和ApDMT2基因与它们在核苷酸水平上序列相似性分别为83％和84％，氨基酸序列相似性分别达93％和91％。与其它物种的转甲基酶相比，在氨基酸水平上，ApGSMT2与EcGSMT(来源于Ectothiorhodospirahalochloris，一种厌氧光合硫细菌)为64％，与AcGSDMT(来源于Actinopolysporahalophila，一种需氧异养真细菌)为64％；ApDMT2与EcSDMT为50％，与AcGSDMT为48％。在ApGSMT2和ApDMT2基因编码的氨基酸序列中，存在保守的AdoMet(腺苷甲硫氨酸)结合基序：MotifⅠ，PostⅠ，MotifⅡ和MotifⅢ。蛋白结构预测得出ApGSMT2和ApDMT2各具有一个由7个β-折叠片构成的“AdoMet-dependent MTase fold(AdoMet依赖的甲基转移酶折叠)”结构，且这7个β-折叠片是按照(6↓7↑5↓4↓1↓2↓3↓)顺序排列。这个结构被认为是甲基转移酶(Mtases)的特征结构。
　　 为了确定ApGSMT2和ApDMT2基因的功能，将它们共转入E.coli和模式植物烟草中，检测转基因大肠杆菌和转基因烟草中甜菜碱含量。在E.coli中共表达ApGSMT2和ApDMT2基因导致甜菜碱的合成量增加，与未转基因对照细胞相比，在正常培养条件下甜菜碱含量增加1倍左右。烟草自身不合成甜菜碱。表达ApGSMT2和ApDMT2基因的转基因烟草(GSD株系)中能够积累甜菜碱(可达0.4436μmol g-1FW)。与转betA基因烟草(betA株系)相比，GSD株系的甜菜碱积累量是betA株系的4.3倍。betA基因编码催化胆碱合成甜菜碱的酶。不同的甜菜碱积累量可能是两种转基因烟草合成甜菜碱的底物不同的缘故，GSD株系以甘氨酸为底物，betA株系以胆碱为底物。游离甘氨酸在烟草细胞中含量丰富，而胆碱的含量比较低。在20％的PEG水溶液中，GSD株系种子萌发率高达65.2％，显著高于betA株系(50.9％)。小苗干旱试验也表明，GSD植株在干旱胁迫下的生长状况远远好于转betA株系的。生理指标检测得出，与转betA株系和野生型相比，干旱胁迫下GSD植株的相对含水量(RWC)较高，膜受损程度较轻，还能保持相对较高的净光合速率和PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)。因而在GSD株系中，甜菜碱可能主要通过在干旱胁迫下维持细胞膜的完整性和稳定PSⅡ中心复合体提高转基因烟草的抗旱性，抗旱能力与甜菜碱的积累量正相关。
　　 在此部分工作中，我们克隆出ApGSMT2和ApDMT2基因，它们编码的蛋白催化甘氨酸甲基化合成甜菜碱。对转基因烟草进行抗旱性分析，得出GSD株系的甜菜碱积累量高于转betA株系的，抗旱性也优于转betA株系的。这些结果表明ApGSMT2和ApDMT2基因在植物抗逆基因工程研究中有很好的应用前景。转ApGSMT2和ApDMT2基因黑麦草的产生为了转化单子叶植物黑麦草，将ApGSMT2和ApDMT2基因重组到一个单子叶植物表达载体质粒上。在这个质粒中，ApGSMT2和ApDMT2基因分别被玉米ubiquitin启动子启动转录。以抗除草剂草甘膦的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(Epsps)基因为植物转化选择标记。通过农杆菌介导的从生芽块转化法将ApGSMT2和ApDMT2基因转入一年生黑麦草和多年生黑麦草。通过除草剂筛选和PCR检测选择转基因黑麦草植株，采用Southern杂交技术进‘步确定外源基因是否整合入黑麦草基因组中，利用反转录PCR技术确定外源基因在转基因黑麦草中的表达。从黑麦草转化植株中选出了一批稳定的转基因材料。转ApGSMT2和ApDMT2基因黑麦草的抗旱性分析分别以3个转基因多年生黑麦草T0代无性系和3个来自不同转化体的转基因一年生黑麦草T2代株系为材料进行抗旱性分析。把转基因多年生黑麦草和野生型(WT)的大小基本一致分蘖移栽到土质均一的花盆中，地上部分修剪成5 cm高，恢复生长4周后，停止供水进行干旱胁迫处理。对于转基因一年生黑麦草T2代和WT的种子播种到花盆中，经除草剂筛选和PCR检测后，恢复生长一个月后进行干旱胁迫处理。
　　 在干旱处理过程中，WT比转基因黑麦草植株萎蔫早，生长受抑制严重，而转基因黑麦草植株根系更发达，萎蔫较晚，能够积累更多的生物量。经过长时间的干旱胁迫处理，所有的黑麦草株系叶片卷曲，严重失水；但复水后转基因黑麦草植株可以较快恢复生长，表现出较高的存活率。这些表型观察的结果表明转ApGSMT2和ApDMT2基因提高了黑麦草的抗旱能力。
　　 干旱处理前，转基因多年生黑麦草和转基因一年生黑麦草的甜菜碱含量分别为3.60～3.83μmol-1FW和2.19～2.31μmol g-1FW，与WT相比没有明显差异。干旱处理7天后，转基因黑麦草和WT的甜菜碱积累量均大幅度升高，前者升高幅度更大。如转基因多年生黑麦草L3的甜菜碱含量达17.34μmol g-1FW，是WT7.91μmol g-1FW的2.19倍；转基因一年生黑麦草L3的甜菜碱含量为6.12μmolg-1FW，是WT4.3μmol g-1FW的1.42倍。对转ApGSMT2和ApDMT2基因黑麦草的转基因表达分析得出，干旱胁迫下甜菜碱的含量同转基因表达量呈正相关，即转基因黑麦草在干旱胁迫处理中的甜菜碱增加与转基因表达强度相对应。
　　 测定转基因黑麦草和WT在干旱处理过程中的生理指标，以探讨转基因黑麦草抗旱性提高的可能机制。干旱处理过程中所有黑麦草株系的叶片RWC和净光合速率(Pn)均下降，但转基因黑麦草的叶片RWC和Pn的降低幅度显著小于WT的，并且转基因黑麦草的离子渗漏率和丙二醛(MDA)积累水平均低于WT，即转基因黑麦草株系的叶片细胞膜受损程度较轻。这些结果表明转基因黑麦草的甜菜碱含量增加有效地稳定了细胞膜的完整性，这可能是叶片保持相埘较高RWC和Pn的原因之一。同WT相比，干旱胁迫过程中转基因黑麦草株系能保持相对较高的Pn，一部分归因于轻微干旱下较高的气孔导度(gS)能够保证CO2供应，另一方面归因于PSⅡ中心复合体在严重胁迫下受损较轻。干旱胁迫下转基因黑麦草的Fv/Fm值高于WT，表明更多甜菜碱的积累可能也有效地保护PSⅡ中心复合体结构及功能。由于在干旱胁迫下转基因黑麦草能保持较强的光合能力，因此叶片可积累较多的可溶性糖。
　　 高等植物中各氨基酸的合成途径之间存在密切联系，一种氨基酸量的变化有可能影响整个游离氨基酸库。考虑到转基因黑麦草消耗甘氨酸合成甜菜碱，有必要分析转基因黑麦草中各游离氨基酸的水平。干旱处理前转基因黑麦草和WT的各游离氨基酸含量没有显著差异。干旱处理7天，转基因一年生黑麦草的Gly、Ser和Thr含量显著低于WT的，而转基因多年生黑麦草中仅有Gly显著低于WT。这可能是因为转基因黑麦草中，Gly被消耗合成甜菜碱，需较多的Ser用于Gly合成的结果。干旱胁迫下，植物能够积累游离氨基酸，尤其是Pro作为渗透调节保护物质。干旱胁迫后转基因黑麦草和WT的游离氨基酸总量和Pro含量均大幅度增加，但转基因材料和WT之间没有明显差异，这表明同WT相比，转基因黑麦草抗旱能力的提高与游离氨基酸总量和Pro含量变化无关。
　　 检测转基因多年生黑麦草中干旱胁迫相关基因的表达变化，探讨引入新的甜菜碱合成途径对其他基因表达的影响。选择的基因有两个DREB/CBF转录因子基因的同源基因、D1蛋白编码基因、催化合成胆碱的磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因和AQPs基因等。AQPs是水通道蛋白，植物可以通过控制AQPs活性来抵御干旱胁迫，比较分析4个多年生黑麦草的水通道蛋白基因的表达变化，发现LpTIR2:1和LpTIR1:2基因的表达在转基因植株和WT间有差异，黑麦草积累更多甜菜碱可能促进了它们的表达。但是多数基因的表达趋势在转基因株系和WT之间无明显差别，即未受到转基因的影响。
　　 在此部分研究中，通过转ApGSMT2和ApDMT2基因，将甘氨酸甲基化合成甜菜碱途径首次引入黑麦草中。异源表达ApGSMT2和ApDMT2基因增加了黑麦草中甜菜碱的积累量，抗旱能力得到显著提高。生理学和分子生物学分析表明干旱胁迫下在转基因黑麦草中甜菜碱不仅能够稳定细胞膜的完整性和PSⅡ中心复合体，而且还可能影响一些胁迫相关基因的表达。
　　 综上所述，本工作克降出编码催化甘氨酸甲基化合成甜菜碱的ApGSMT2和ApDMT2基因，通过转基因植物证实了其应用价值，丰富了抗逆植物基因工程研究的基因资源。另外，获得了抗旱性明显提高的转基因黑麦草材料，为我国黑麦草育种工作做出力所能及的贡献；通过干旱胁迫下对转基因黑麦草进行比较系统的生理学分析与部分基因表达分析，还为深入了解转基因黑麦草抗旱分子机制提供了重要资料。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

1.1 干旱胁迫对植物的影响

1.2 植物的抗旱机制

1.2.1 植物抗旱的形态特征

1.2.2 植物抗旱的分子机制

1.3 甜菜碱合成机制在植物基因工程中的应用

1.3.1 甜菜碱的生物合成途径

1.3.2 甜菜碱的植物基因工程研究

1.3.3 甜菜碱的抗逆作用机制

1.4 黑麦草基因工程改良研究进展

1.4.1 提高牧草品质

1.4.2 提高抗病害能力

1.4.3 抗除草剂品种的培育

1.4.4 控制花粉过敏原的产生

1.4.5 提高逆境抗性

1.5 本研究的目的与意义

第二章 甘氨酸甲基化合成甜菜碱途径中相关基因的克隆与功能分析

2.1 材料与方法

2.1.1 藻种及其培养

2.1.2 植物材料

2.1.3 菌种及质粒载体

2.1.4 嗜盐隐杆藻基因组DNA的提取

2.1.5 嗜盐隐杆藻GSMT和DMT基因的克隆

2.1.6 质粒重组和鉴定

2.1.7 ApGSMT2和ApDMT2蛋白在大肠杆菌中的表达

2.1.8 ApGSMT2和ApDMT2基因在大肠杆菌中的功能验证

2.1.9 转基因烟草的获得

2.1.10 转ApGSMT2和ApDMT2基因烟草的抗旱性实验

2.1.11 数值统计分析

2.2 结果与分析

2.2.1 嗜盐隐杆藻GSMT和DMT基因的克隆

2.2.2 嗜盐隐杆藻GR02中GSMT和DMT基因的序列分析

2.2.3 原核共表达载体pET-30a(+)GSD的鉴定

2.2.4 ApGSMT2和ApDMT2蛋白在大肠杆菌中的共表达

2.2.5 ApGSMT2和ApDMT2基因在大肠杆菌中的功能验证

2.2.6 双子叶植物共表达载体pCPE-GSD的酶切鉴定

2.2.7 转ApGSMT2和ApDMT2基因烟草的抗旱性分析

2.3 讨论

第三章 转ApGSMT2和ApDMT2基因黑麦草的产生与抗旱性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 pCUE-GSD质粒的构建

3.1.2 农杆菌介导的黑麦草遗传转化

3.1.3 转基因黑麦草抗旱性分析

3.2 结果与分析

3.2.1 单子叶植物共表达载体质粒pCUE-GSD的鉴定

3.2.2 转ApGSMT2和ApDMT2基因黑麦草植株的获得

3.2.3 转基因黑麦草的Southern杂交和转基因表达分析

3.2.4 转基因黑麦草的抗旱性分析

3.2.5 干旱胁迫相关基因在转基因黑麦草中的表达分析

3.3 讨论

3.3.1 转ApGSMT2和ApDMT2基因提高了黑麦草的抗旱性

3.3.2 干旱对转基因黑麦草游离氨基酸含量的影响

3.3.3 甜荣碱积累时黑麦草基因表达的影响

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

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