内皮抑素在肺腺癌中的表达及其小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响

摘要

研究背景和目的：
　　 肺癌是一个世界范围内的严重危害人们健康的恶性肿瘤，已居各类恶性肿瘤死亡率首位。特别是肺腺癌，早期症状不明显，缺少有效的早期、无创检查方法，并且具有高侵袭性、高转移性的生物学特性，早期即可发生血液和淋巴转移，因而研究肺腺癌的血管和淋巴管生成及转移的相关分子机制，寻找阻断其血液和淋巴转移的新方法，具有非常重要的意义。
　　 传统的治疗包括手术、化疗和放疗等均不能很好的组织肿瘤的转移，随着对肿瘤认识的逐渐深入，现已知道实体肿瘤的发生、生长、浸润以及转移均依赖于新生血管的形成，因此抗血管生成治疗如血管抑素、内皮抑素等的发现和应用为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。然而，淋巴管系统与血管系统是一个互为交通的网络结构，肿瘤细胞可在两个管道系统之间自由进出，单纯阻断血管途径并不能很好地控制肿瘤细胞远处转移，而且肿瘤血管生成的过程也需要淋巴管参与，因此近年来关于肿瘤淋巴管生成的研究越来越得到重视。
　　 内皮抑素是O’Reilly等首先从培养的鼠内皮细胞瘤上清液中发现的血管生成抑制因子，它能特异性抑制血管内皮细胞增殖并明显地抑制肿瘤的生长和转移。体外实验证实，endostatin对淋巴管内皮细胞增殖亦具有明显的抑制作用，而且呈剂量依赖性，而endostatin是否具有抑制肿瘤淋巴管生成进而抑制肿瘤淋巴转移的作用，目前关于此方面的研究国内外均少见。endostar是在endostatin上添加了9个氨基酸的新型重组endostatin，稳定性高、纯度高，为研究endostatin抗淋巴管生成的研究提供了简便易行的途径。
　　 本课题首先检测了人肺腺癌endostatin表达和微淋巴管密度(MLVD)，研究endostatin在肺腺癌中的表达及其与淋巴管生成和淋巴转移的相关性；然后建立Lewis肺癌小鼠模型，对重组内皮抑素endostar对Lewis肺癌生长及淋巴管生成的影响进行了研究，以期为今后endostatin应用于肺癌的抗淋巴转移治疗提供一定的理论依据。
　　 材料和方法：
　　 第一部分人肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系
　　 60例肺癌组织标本取自山东大学第二医院胸外科自2006年3月～2009年5月接受手术治疗的病人，所有病人术前均未接受过放疗或化疗等治疗，术后病理均证实为肺腺癌。其中：男33例，女27例；年龄45～69岁。60例标本中，低分化腺癌29例，高中分化腺癌31例；中心型肺癌32例，周围型肺癌28例。根据UICC1997年肺癌P-TNM分期标准，Ⅰ期+Ⅱ期25例，Ⅲ期+Ⅳ期35例。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(Streptavidin-peroxidase，S-P)免疫组织化学方法检测肺癌组织endostatin蛋白的表达及肺癌组织微淋巴管密度(Microlymphatic vessel density，MLVD)，一抗endostatin单抗购自美国Santa Cruz公司，D2-40抗体购自英国Abcam公司，S-P试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。endostatin根据细胞染色强度和染色细胞所占面积积分之和来判断。染色强度积分：不染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色面积：无细胞染色为0分，<25％细胞染色为1分，25％～50％细胞染色为2分，>50％细胞染色为3分；两者积分之和>2，则为表达阳性，≤2则为表达阴性。D2-40阳性染色的内皮细胞计为淋巴管，先在低倍镜(100倍)下寻找阳性脉管密集区，然后换高倍镜(400倍)选取5个视野计数，取其平均值作为每例的MLVD。
　　 第二部分重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响
　　 复苏Lewis肺癌瘤种，种植于C57BL/6小鼠右腋下，传至第3代，将瘤细胞取出，研磨，筛网过滤，调细胞浓度为5×106/L，进行尾静脉注射，每只小鼠注射约1×104个细胞。肿瘤接种8天后，随机将小鼠分为两组，每组20只。对照组接受生理盐水皮下注射，0.2ml/(天·只)；实验组接受重组内皮抑素endostar。皮下注射，500μg/(天·只)；连续注射15天。接种瘤细胞后开始观察，观察期为6周。观察期结束后处死小鼠，剖胸取出肺脏，并收集淋巴结(包括颈上淋巴结群、臂部淋巴结群、椎旁淋巴结群、颈深淋巴结群、纵隔淋巴结群)。放大镜下计数肺表面长径大于2mm的肿瘤数，并用游标卡尺测量每个肿瘤长径，平均肿瘤长径=肿瘤长径之和/肿瘤数。肺肿瘤标本固定、脱水并包埋。切片分别做D2-40和VEGF-C的免疫组化染色。
　　 RT-PCR法检测VEGF-C mRNA在小鼠肺腺癌新鲜组织中的表达。按照Trizol的说明书，先用Trizol一步法提取小鼠肺癌组织中的总RNA，然后用紫外分光光度计测定纯度并定量。引物序列：VEGF-C5’-AAGACCGTGTGCGAATCGA-3’5’-ACACAGCGGCATACTTCTTCAC-3’β-actin5，-CACTATTGGCAACGAGCGG-3’5’-TCCATACCCAAGAAGGAAGGC-3’
　　 采用贝西生物技术有限公司RT-PCR试剂盒。取总RNA1μg，加入DEPC处理的0.5ml Eppendorf管中，组成20μl逆转录反应体系中，于37℃，1h，95℃10分钟灭活MMLV，终止逆转录。按如下条件组成PCR反应体系，
　　 1.5％琼脂糖电泳鉴定。半定量分析：用凝胶成像分析系统测出VEGF-C和β-actin mRNA的表达强度，或计算相对系数。相对系数=特异性基因表达强度/β-actin表达强度。
　　 结果：
　　 1，肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系
　　 肺腺癌组织中endostatin阳性染色位于细胞浆和细胞核，以细胞浆表达为主，肿瘤间质细胞也可见阳性染色。Endostatin在60例肺腺癌组织中23例表达为阴性，37例阳性表达，阳性率为61.7％。D2-40阳性脉管呈管腔状、条索状，弥漫或散在分布在癌巢周围间质，常可见癌细胞浸润。Endostatin阳性组MLVD为7.68±1.89，阴性组为9.17±1.95，差异有统计学意义(P<0.01)。单因素方差分析显示，MLVD在不同程度endostatin表达的病例中，随着endostatin表达积分的增高，MLVD减少。Endostatin表达与肿瘤分期有关，Ⅰ～Ⅱ期endostatin阳性表达率显著高于Ⅲ～Ⅳ期(P=0.014)；endostatin阳性组淋巴结转移较阴性组减少(P=0.013)。Endostatin的表达与肿瘤大小、细胞分化程度相关(P<0.05)，与患者性别、年龄和位置无明显相关性。
　　 2，重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响
　　 对照组及实验组小鼠肺癌发生率均为90％(18/20)，两组分别有两只小鼠未见肺肿瘤发生，不计入统计。对照组小鼠肺表面肿瘤数为5.61±1.24，实验组为4.67±1.14，差异有显著性意义(P=0.023)；对照组肿瘤平均长径为4.033±0.526，实验组为3.461±0.658，差异有显著性意义(P=0.007)。对照组和实验组小鼠分别发现有8例和2例有淋巴结转移，两组差异有统计学意义(P=0.026)。对照组小鼠肺癌组织微淋巴管密度为7.78±1.56，实验组为5.67±1.57；差异有显著性意义(P<0.01)。免疫组化显示对照组小鼠中VEGF-C阳性率为66.7％(12/18)，实验组为27.8％(5/18)，对照组VEGF-C表达阳性率高于实验组(P=0.019)。对照组和实验组肺癌组织中VEGF-C mRNA都有不同程度的表达，对照组癌中高表达(0.644±0.109)，实验组中低表达(0.334±0.104)(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1，Endostatin在肺腺癌中的表达与微淋巴管密度和淋巴结转移相关。
　　 2，Endostatin表达与肺癌肿瘤大小、细胞分化程度及病理分期相关，与性别、年龄和肿瘤位置无相关性。
　　 3，重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌生长、淋巴管生成和淋巴结转移均具有抑制作用。
　　 4，重组内皮抑素可下调肺癌VEGF-C基因表达，并进而影响肿瘤生长和淋巴管生成。