酵母模式生物用于依赖DNA序列的核小体定位实验初步研究

摘要

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位，它不仅起基本的结构作用，更重要的是通过其在基因组上的定位及其组蛋白复合物的化学修饰调控诸如 DNA复制、转录和修复等基因表达过程。核小体定位是在表观遗传学水平上调控基因表达的重要层次。研究表明，核小体定位主要受两种因素影响，一是DNA序列，二是一些反式作用因子。
　　真核生物复制起始的调控是复制调控的一个重要环节，酵母复制依赖的顺式作用元件称为自主复制序列(ARS)，该序列趋向于核小体缺乏区，但其活性并不完全由核小体位置决定，还可能与两侧的序列特征和核小体分布有关系。本文利用体外组装核小体技术、DNA标记技术等，以酵母ARS为研究对象，探讨序列特征对核小体定位及自主复制序列活性的影响。具体研究内容如下：
　　1.测定了酿酒酵母YPH499的生长曲线，在YPD液体培养基中30℃、200r/min振荡培养12-22h的时间段内酵母处于对数生长期，其倍增时间为2.008h。
　　2.分别采用了溶菌酶处理法、蜗牛酶过夜处理法、蜗牛酶反复冻融处理法、珠磨法提取酵母基因组，结果表明：溶菌酶法不能够提取酵母基因组，其他三种方法均能提取出酵母基因组DNA，相比较珠磨法提取的酵母基因组质量高、成本低、时间短且操作简单，是提取酵母基因组DNA的最佳方法。
　　3.利用BrdU标记整合了带有HSV–TK和hENT1基因的酿酒酵母DNA，液体振荡培养14h加入BrdU，分别标记1、3、5h，用DAPI对整个基因组DNA染色，再利用带有 FITC荧光标记的抗体检测 BrdU，发现标记3h时荧光强度最大，大约55.3％的酵母基因组DNA中渗入了BrdU。
　　4.采用酸抽提的方法从未饥饿处理和经过不同时间饥饿处理的酵母细胞中提取组蛋白，经15% SDS-PAGE电泳检测、Bradford法测定蛋白浓度，结果显示：抽提物中含有组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4，从未饥饿处理的酵母细胞中提取的组蛋白浓度高，但有部分杂蛋白存在；经不同时间饥饿处理的酵母细胞中提取的组蛋白浓度较低，但是杂蛋白含量明显减少；且随着饥饿时间的延长，组蛋白和杂蛋白含量都逐渐减少。
　　5.采用601序列建立体外组装体系及检测方法，将纯化的酵母ARS304、305与纯化的组蛋白八聚体在体外梯度盐透析组装形成核小体，利用EB及Biotin标记检测，结果显示：不同组蛋白八聚体与DNA的比例形成核小体的数量不同，同一比例下ARS304、305形成核小体的能力不同，ARS305较ARS304结合核小体能力强。

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引 言

1 文献综述

1.1 核小体及核小体定位

1.2 酵母

1.3 核小体体外组装及检测技术

2 实验材料与方法

2.1 酵母菌的培养及生长曲线测定

2.2 酵母菌基因组的提取与检测

2.3 酵母转化

2.4 BrdU标记酵母基因组

2.5 酵母组蛋白提取

2.6 核小体体外组装

3 结果与分析

3.1 酵母菌生长曲线测定

3.2 酵母基因组的提取与检测

3.3 BrdU标记基因组检测酵母ARS复制活性

3.4 酵母组蛋白提取及检测

3.5 核小体体外组装

4 讨论

结 论

参考文献

在学研究成果

致谢