人类精子在液氮和液氮蒸汽中冷冻储存的比较性研究

摘要

[目的]精子冷冻技术已经被广泛应用于生殖领域,它可以为人类提供生殖保险,为不孕不育夫妇提供合格的精子。在过去的几十年,精子冷冻技术虽然得到了一定的发展,但是,冷冻过程中冰晶的形成以及氧化应激反应对精子造成损伤(包括细胞膜、运动能力、DNA、线粒体功能等)是一直存在的,而这些损伤则会导致精子授精能力的下降。为了保存精子的活力,许多研究者将塑料冷冻管浸入液氮中进行长期储存。但是,非无菌的液氮经常会渗入冷冻管中,导致微生物污染的风险。在本研究中,我们对人类精液标本采用液氮和液氮蒸汽两种方法进行冷冻储存,主要观察:1.不同冷冻储存方法对前向运动精子比率、畸形率、DNA完整性等的影响。2.冷冻储存不同时间对前向运动精子比率、畸形率、DNA完整性等的影响。3.探索能够避免交叉污染的低温储存方法,为今后的研究提供实验依据。
　　 [方法]山东省人类精子库中随机选取正常精液质量样标本48例(精液检测严格按照世界卫生组织《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》(1999年第四版)的方法进行,入选标准按照2001年卫生部颁发的《人类精子库基本标准和技术规范》的要求:精液液化时间少于60分钟,精液量大于2毫升,精子密度>60×106／ml,(a+b)级精子>50％,精子正常形态率>3096)。全部标本均来自体检合格捐献精子的志愿者,取精前志愿者禁欲3～7d,留取精液于无菌取精杯内,在培养箱中完全液化后,行精液常规检查。精液标本完全液化后,留取0.5ml精液用于检测冻前指标,其余精液用于检测冻后指标。将精液与等量的冷冻保护剂充分混匀后平均分为八等份,在室温下静置10min后进行相应步骤的静态的蒸汽冷冻15min,四份标本直接投到液氮中(-196℃),另外四份储存在液氮蒸汽罐中(-167℃)。分别在第2天、7天、30天、180天后在37℃水浴箱中进行复苏。主要检测指标:用Makler计数板人工检测前向运动精子比率,采用精子形态学快速染色(Diff-Quik法)试剂盒检测精子的畸形率,荧光染料吖啶橙标记精子DNA,荧光显微镜下检测精子DNA损伤。本研究通过医院伦理委员会批准,并获得志愿者知情同意。
　　 [结果]冷冻后所有的精子质量都受损。与液氮相比较,储存于液氮蒸汽中的前向运动精子比率、畸形率和DNA完整性等没有明显区别(P>0.05)。两组中,随着冷冻储存时间的推移,前向运动精子比率、畸形率和DNA完整性等呈逐渐降低的趋势。液氮蒸汽中冷冻储存达180天时,上述指标皆有显著性差异(P<0.05)。
　　 [结论]在液氮蒸汽中和液氮中冷冻储存人类精子的效果是一致的,前者可以取代液氮成为对精液标本长期储存的一种选择。液氮蒸汽冷冻储存精子时,应该尽量减少存储时间或者操作频率,减轻冷冻温差对精子的影响,最大可能的避免病原微生物的交叉污染。