Slit/Robo信号通路和芳香烃受体(AhR)在卵巢肿瘤组织及卵巢癌细胞系中表达和意义的实验研究

摘要

第一部分 Slit/Robo信号通路在卵巢肿瘤组织及卵巢癌细胞系中表达和意义的实验研究
　　 研究背景：Slit/Robo家族最早在中枢神经系统中被发现。Slit蛋白是一类分泌性糖蛋白，脊椎动物中包括三个Slit成员(Slit1-3)，它通过受体Roundabout(Robo)发挥其作为神经元迁移的排斥性因子和神经轴突导向的作用。哺乳动物的Slit蛋白结构由一个N-端信号肽，四个富含亮氨酸的重复序列(LRRs)，九个EGF样重复序列和一个C-端的半胱氨酸结组成，LRRs是Slit与受体Robo结合必需的区域。Slit在蛋白水解过程中产生N-末端和C-末端两个片段，只有全长和N-末端Slit能与细胞膜受体Robo结合发挥作用。Robo属于免疫球蛋白超家族的跨膜信号分子，在脊椎动物中有四个成员Robo1-4。Robo1，2，3胞外区是由5个Ig样功能区和3个Ⅲ型纤维连接蛋白(Fibronectin)样结构域组成；Robo4结构与其他成员差异较大，胞外区只有两个Ig样功能区。
　　 Slit/Robo在人类多种肿瘤中均发现有表达，关于其作用的报道则是不一致的。有研究表明，Slit/Robo可作为肿瘤抑制因子，例如在肺癌和乳腺癌中可检测到ROBO1基因纯合子缺失；Slit2可抑制乳腺及直肠肿瘤细胞的生长，在乳腺癌、肺癌、直肠癌、及脑癌等多种肿瘤中Slit/Robo启动子基因甲基化导致其失去活性；与正常组织或低度恶性肿瘤组织相比，Slit/Robo的表达在包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌及前列腺癌等多种肿瘤中均有下降。与之相反的说法是，某些Slit/Robo成员在很多肿瘤中的表达明显增高。Wang等报道显示，中和阻断Robo1可缩小体内恶性黑色素瘤体积并降低肿瘤的微血管密度，表明Slit/Robo可通过促进血管的生成加剧癌症的发生及发展。因此，依据不同的肿瘤类型，Slit/Robo发挥促进或者抑制肿瘤发展的作用。
　　 Slit/Robo在多种肿瘤中的表达和作用已被探讨，且证实SLIT1、SLIT2、SLIT3、ROBO1基因在一系列上皮性恶性肿瘤中均作为候选肿瘤抑制基因。在卵巢恶性肿瘤中，约90％为上皮性卵巢癌，但是Slit/Robo家族在卵巢肿瘤中的表达及功能却未有报道，鉴于此，首次应用卵巢肿瘤组织芯片对Slit/Robo家族主要成员(Slit2/3及Robo1/4)在正常卵巢组织及不同组织学类型的卵巢肿瘤组织中的表达情况进行检测，并利用增殖和迁移实验探讨Slit/Robo信号通路是否对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3增殖侵袭能力产生影响。
　　 研究目的：
　　 1.检测Slit/Robo信号通路的主要成员在正常卵巢组织和不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织及卵巢癌细胞系中的表达；
　　 2.探讨Slit2对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3增殖、迁移能力的影响；
　　 3.研究Slit2对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3细胞内ERK1/2和AKT1磷酸激酶的影响。
　　 研究方法：
　　 1.免疫组织化学方法：检测在正常卵巢组织和不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤中Sti2/3和Robo1/4的表达，分别以山羊和兔IgG代替一抗作为阴性对照；采用半定量法判定结果，使用ImageJ和Meta Morph图像分析软件测得图片OD值；SigmaStat统计软件分析不同组织学类型肿瘤组织之间数值的统计学差异；
　　 2.Western Blot分析法：检测在人卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞中Slit2/3和Robo1/4蛋白的表达；以GAPDH和β-actin作为内参照物；
　　 3.24孔-Transwell系统：检测Slit2处理后卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞的侵袭能力；
　　 4.结晶紫实验：检测Slit2处理后卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞的增殖能力；
　　 5.细胞划痕试验：检测Slit2处理后卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞的增殖迁移能力；
　　 6.Western Blot分析法：检测Slit2处理后卵巢癌细胞内ERK1/2和AKT1的磷酸化水平。
　　 结果：
　　 1.Slit2/3和Robo1/4在正常卵巢组织和卵巢肿瘤组织中的表达：8例正常卵巢组织和8例癌旁正常组织合为一组称正常对照组，共16例，各不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织称为研究组，共192例。在对照组中可检测到Slit2、Slit3和Robo1呈不同程度的阳性表达，主要分布在卵巢基质细胞；在研究组中Slit2/3和Robo1/4可见不同程度的阳性表达；阴性对照组均未见有着色。
　　 1)Slit2：在正常对照组、高低级别浆液性囊腺癌、卵黄囊瘤、颗粒细胞瘤和无性细胞瘤中可见阳性着色(OD>2000±680)，阳性率分别为75％(12/16)，69％(79/115)，100％(21/21)，100％(6/6)，75％(3/4)和80％(4/5)。正常对照组中OD=1971±681，在低级别浆液性囊腺癌中OD=6048±2216，卵黄囊瘤OD=4797±1369，统计分析结果显示OD值增高较正常对照组有统计学意义；
　　 2)Slit3：无性细胞瘤OD=17562±4463，阳性率为100％(5/5)；卵黄囊瘤OD=16627±6986，阳性率为100％(6/6)。正常对照组OD=1248±789，统计分析结果显示在无性细胞瘤和卵黄囊瘤中OD值增高较对照组相比差异有统计学意义；
　　 3)Robo1：在对照组和研究组均有较强阳性着色(OD>9640±640)，阳性率均为100％。低级别浆液性囊腺癌OD=33025±3513，高级别浆液性囊腺癌OD=23268±1744，粘液性囊腺癌OD=15336±2213，无性细胞瘤OD=32667±9646，卵黄囊瘤OD=40824±4033，与正常对照组OD=9640±640相比，OD值明显增高，差异有统计学意义；
　　 4)Robo4：无性细胞瘤OD=7100±6200，阳性率为80％(4/5)；卵黄囊瘤OD=1570±6980，阳性率为100％(6/6)。与正常对照组OD=452±301相比，OD值明显增高，差异有统计学意义。
　　 2.Slit2/3和Robo1/4蛋白在人卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞中的表达：Slit2抗体在～50KDa左右检测到蛋白条带，该位置对应于Slit2 C-末端，与阳性对照(human hepatoblastoma cells)一致；Slit3抗体在～45和～65KDa左右检测到蛋白条带，对应于Slit3 C-末端，与阳性对照(mouse thyroid extract)结果一致；均未检测到全长Slit2/3(～200KDa)和N-末端(～140KDa)。Robo1/4抗体分别在～250KDa和～170KDa左右检测到蛋白条带，对应于全长Robo1/4。
　　 3.人重组Slit2蛋白对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞增殖侵袭能力的影响：5，10，100 ng/ml Slit2蛋白作用4 d后，与对照组(增殖率为100％)相比，OVCAR-3细胞的增殖率分别为111％，113％，113％；SKOV-3细胞增殖率分别为109％，103％，97％；与对照组相比差异均无统计学意义(p>0.05)。100 ng/ml Slit2蛋白处理OVCAR-3和SKOV-3细胞16h后，SKOV-3细胞迁移数目为985±77，对照组为1020±84，两组相比细胞迁移数目差异无统计学意义；OVCAR-3细胞无迁移。
　　 4.人重组Slit2蛋白对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞内ERK1/2和AKT1磷酸激酶的影响：Slit2蛋白处理细胞0，10m，30m，1h，3h后，与对照组(设为1)相比，OVCAR-3细胞内ERK1/2磷酸化水平分别为1.0±0.0，2.4±0.9，1.5±0.7，1.3±0.3，1.8±0.7；AKT1磷酸化水平分别为1.0±0.0，3.4±2.1，3.3±1.8，2.7±0.8，2.9±1.3；SKOV-3细胞内ERK1/2磷酸化水平分别为1.0±0.0，1.2±0.3，2.1±0.7，2.2±1.0，1.3±0.4；AKT1磷酸化水平分别为1.0±0.0，1.1±0.4，1.8±0.9，1.0±0.2，1.0±0.3。统计分析结果显示两组相比差异无统计学意义。
　　 结论：
　　 1.Slit/Robo信号通路中主要成员Slit2/3和Robo1/4在卵巢癌组织中的阳性表达显著高于正常卵巢组织中的表达水平；
　　 2.人重组Slit2蛋白对卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞生长增殖、侵袭迁移能力无明显促进作用；
　　 3.人重组Slit2蛋白未激活卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞内ERK1/2和AKT1磷酸激酶。
　　 第二部分芳香烃受体(AhR)在卵巢肿瘤组织中表达及对卵巢癌细胞系增殖迁移能力影响的实验研究
　　 研究背景：芳香烃受体(AhR)是一类配体激活转录因子，它在细胞外信号激活下，通过DNA结合调控相应的基因表达，可介导多环芳烃类化合物的毒性反应(包括致癌性)，还参与一些重要的生物学过程，如信号转导、细胞分化、细胞凋亡等。未与配体结合的情况下大部分AhR位于细胞胞浆内，配体结合后，通过芳香烃受体核转因子(ARNT)，AhR被转运到细胞核。细胞核内的AhR与DNA上的AhR增强子序列反应元件(DRE)结合，可激活包括细胞色素酶如CYP1A1，CYP1A2和CYP1B1等下游基因的表达。CYP1A1，CYP1A2和CYP1B1是三种被广泛研究的外源性物质代谢酶，其功能主要是降解外源性有毒物质。同时AhR还会激活p53和p21等基因，从而影响细胞周期调控，以及细胞生长。
　　 已有研究表明2-(1’H-吲哚-3’-羰基)噻唑-4-羧酸甲酯[2-(1’H-indole-3’-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester，ITE]是内源性的AhR配体，最早是从猪的肺组织中提取的。ITE可结合AhR，激活含DRE的DNA序列的报告基因，其生物效价是BNF(人工合成AhR配体)的5倍。此外，在小鼠肝癌细胞中，ITE的活性可达到TCDD的5-6倍。由于ITE是自然代谢产物无毒性作用，并能高效结合AhR，因此可作为一种潜在的抗癌药物。虽然AhR在人类卵巢癌发生发展过程中的功能仍然不清楚，但AhR在人类卵巢癌中有高表达并且其配体TCDD可以刺激卵巢癌细胞系CAOV-3的增殖等现象均表明AhR在卵巢癌进展过程中发挥一定的作用。因此，本实验我们对AhR及其配体ITE在卵巢癌发生发展机制中的作用进行探讨。
　　 研究目的：
　　 1.检测AhR在正常卵巢组织及不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织中的表达，并探讨其临床意义；
　　 2.探讨ITE对人卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3细胞增殖和迁移能力的影响。
　　 研究方法：
　　 1.组织芯片免疫组织化学方法：检测在正常卵巢组织和不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤中AhR的表达。采用半定量法判定结果，使用Image J和Meta Morph图像分析软件测得图片OD值；Sigma Stat统计软件分析不同组织学肿瘤组织之间数值的统计学差异；
　　 2.结晶紫实验：检测ITE处理后OVCAR-3和SKOV-3细胞的生长增殖能力；
　　 3.24孔-transwell系统：检测TTE处理后OVCAR-3和SKOV-3细胞的迁移能力。
　　 结果：
　　 1.AhR在正常卵巢组织和卵巢肿瘤组织中的表达：8例正常卵巢组织和8例癌旁正常组织合为一组称正常对照组，共16例，各不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织称为研究组，共192例。正常对照组AhR表达阴性；在192例不同组织学类型的卵巢恶性肿瘤组织中AhR有阳性表达，主要分布在上皮细胞包浆内；阴性对照组均未见有阳性着色。浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、卵黄囊瘤、恶性畸胎瘤中可见较强阳性着色(OD≥5476±1864)，阳性率分别为75％(102/136)，60％(12/20)，83％(5/6)，100％(5/5)。在低级别浆液性囊腺癌中OD=17140±1509，高级别浆液性囊腺癌OD=12610±1469，粘液性囊腺癌OD=7416±2214，卵黄囊瘤OD=5880±2183，恶性畸胎瘤OD=5476±1864，OD值较正常对照组(OD=511±103)升高有统计学意义；
　　 2.ITE对卵巢癌细胞OVCAR-3和SKOV-3细胞的生长抑制作用：0.1nM，1nM，10 nM，100 nM，1uM，5uM ITE处理细胞2天后，OVCAR-3细胞增殖率分别为88％，79％，78％，77％，77％，89％，与对照组(100％)相比ITE抑制作用不明显，差异无统计学意义；ITE处理细胞4天后，OVCAR-3细胞增殖率分别为73％，54％，52％，52％，49％，56％；6天后OVCAR-3细胞增殖率分别为60％，38％，31％，33％，33％，39％；与对照组(100％)相比，ITE对细胞生长抑制作用明显，有统计学意义。0.1nM-5uM ITE处理细胞2天后，SKOV-3细胞增殖率分别为105％，106％，109％，118％，108％，104％；4天后为102％，102％，103％，105％，102％，101％；6天后为100％，100％，99％，98％，100％，101％，与对照组(100％)相比，ITE对SKOV-3细胞抑制作用不明显，统计分析结果显示均无统计学意义；
　　 3.ITE对卵巢癌细胞SKOV-3侵袭迁移能力的影响：1uM ITE处理SKOV-3细胞2，4，6天后，SKOV-3细胞迁移数目分别为57±2，54±3，50±8，与对照组(100±2)相比，迁移数目可减少54％；OVCAR-3无迁移能力，未对其进行研究。
　　 结论：
　　 1.AhR正常卵巢组织中无表达，在不同组织学类型卵巢恶性肿瘤中均有表达，提示有可能在卵巢恶性肿瘤的发病中发挥重要作用；
　　 2.ITE可通过芳香烃受体AhR抑制卵巢癌细胞OVCAR-3的增殖能力；
　　 3.ITE可通过芳香烃受体AhR抑制卵巢癌细胞SKOV-3的迁移能力。