核糖核酸内切酶Ⅲ制备的HBV小干扰RNA(esiRNA)文库对乙肝病毒感染的基因治疗

摘要

研究目的:建立HBV esiRNA文库制备技术；研究该文库对HepG2.215细胞内HBV表面抗原(HBsAg)表达的抑制效应。
　　 研究方法:
　　 1.GST-大肠杆菌核糖核酸内切酶Ⅲ(GST-RNaseⅢ)融合蛋白的纯化构建RNaseⅢ重组载体pGEX-KG-RNaseⅢ。将由乳糖操纵子控制的GST-RNaseⅢ表达质粒pGEX-KG-RNaseⅢ转化大肠杆菌BL-21(DE3),挑取单克隆,大量培养并用乳糖类似物IPTG诱导该蛋白表达。收集大量培养的诱导菌株,裂解并应用GST-琼脂糖凝胶珠亲和层析分离GST-RNaseⅢ。应用透析法纯化GST—RNaseⅢ。
　　 2.HBV基因组序列1～540核苷酸(HBV-1)的双向转录模板(T7-HBV-1)以及其转录产物制备及鉴定设计针对HBV-1并的5'端均含有T7启动子的引物,并通过PCR体外扩增得到T7-HBV-1 DNA。应用T7 RNA聚合酶体外转录该模板,同时将转录后产物退火,并鉴定产物为双链RNA(dsRNA),即T7-HBV-1 dsRNA。
　　 3.GST-RNaseⅢ酶活性检测以及反应条件的优化和T7-HBV-1小干扰RNA(T7-HBV-1 esiRNA)文库制备应用等量GST-RNaseⅢ和同量T7-HBV-1dsRNA作为底物反应,确定最佳反应时间,以得到最多的产物。根据最佳反应时间,将GST-RNaseⅢ大量酶切T7-HBV-1 dsRNA为T7-HBV-1 esiRNA文库,最后分离纯化该文库。
　　 4.T7-HBV-1 esiRNA文库效应检测分别将0、50、100和150nmol／L T7-HBV-1esiRNA文库转染携带HBV病毒的HepG2.215细胞三天后,应用半定量以及实时定量PCR检测HepG2.215细胞HBsAg的转录水平变化量；应用HBsAg ELISA试剂盒检测并分析HepG2.215细胞培养基中HBsAg蛋白水平上量的变化。
　　 研究结果
　　 1.成功诱导并纯化GST—RNaseⅢRNaseⅢ DNA扩增片段大小与理论长度一致,同时经过EcoRⅠ和SalⅠ双限制酶切的该片段和pGEX—KG3质粒片段经过连接、转化大肠杆菌Top10感受态菌株,筛选到阳性克隆。从阳性克隆提出来的质粒经酶切鉴定和基因测序证明得到正确的重组载体pGEX—KG—RNaseⅢ质粒。pGEX—KG—RNaseⅢ质粒转化的大肠杆菌表达株BL-21(DE3),经诱导并SDS—PAGE凝胶电泳分析,结果显示:诱导菌株与对照菌株对比,在相对分子量55—72kD之间呈现一条染色较深的条带,且该条带大小与GST—RNaseⅢ蛋白理论分子量相一致,表明成功表达该目的蛋白。透析纯化后的GST—RNaseⅢ蛋白纯度在95％以上,浓度为1.665g／L。
　　 2.鉴定体外转录T7-HBV-1 DNA得到产物为T7-HBV-1 dsRNA T7-HBV-1 DNA片段大小与理论大小(586bp)一致,外转录该片段得到产物大小同T7-HBV-1DNA。产物在非变性状态下不能被DNaseI和RNaseA降解,而解链状态能被RNaseA降解,验证该产物为双链RNA。
　　 3.GST-RNaseⅢ具有酶切T7-HBV-1 dsRNA生成T7-HBV-1 esiRNA的活性随反应时间延长产物片段长度缩短且量减少,反应1小时的产物片段长度多约同于小干扰RNA(siRNA)。纯化后的esiRNA文库大小为20bp左右。
　　 4.T7-HBV-1 esiRNA文库对HepG2.215细胞内的HBV HBsAg的表达有显著的抑制作用半定量以及实时定量PCR结果显示:随转染的esiRNA浓度升高,HBsAgmRNA相对量降低。HBsAg ELISA显示:随转染的esiRNA浓度升高,HepG2.215细胞培养基上清HBsAg蛋白量降低。
　　 结论及意义:用生物学方法制备的HBV esiRNA文库能有效抑制HBV HBsAg在细胞内的表达,为治疗HBV感染开辟了新的思路。同时应用esiRNA文库干扰基因表达原理抑制病毒复制技术也为其他病毒感染临床治疗提供了指导意义。